大鼠神经干细胞提取（小鼠神经干细胞的分离及培养实验）
- 作者: 胡乔煜
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、大鼠神经干细胞提取
大鼠神经干细胞提取
材料：健康大鼠（生后 13 天）
无菌器械（手术刀、镊子、解剖剪）
无菌 PBS 缓冲液
无血清培养基（如 DMEM/F12）
神经干细胞培养基（DMEM/F12、EGF、FGF2）
培养皿（6 孔或 12 孔）
步骤：1. 准备大鼠：用异氟烷麻醉大鼠，然后将其背部朝上放置在无菌手术台上。
2. 消毒手术部位：用 70% 酒精或碘伏消毒大鼠的头皮。
3. 切开皮肤：在头皮中部纵向切开一个约 1 cm 的切口，露出颅骨。
4. 切开颅骨：小心地使用骨剪或钻子切开颅骨，暴露大脑。
5. 去除脑膜：用镊子轻轻剥离大脑表面的脑膜。
6. 分离海马体：定位海马体，用解剖剪将其从大脑中分离出来。
7. 酶解海马体：将海马体转移到无血清培养基中，加入胶原酶和胰蛋白酶，孵育 3045 分钟，以消化组织。
8. 中止酶解：离心酶解混合物，收集细胞沉淀。用无血清培养基重新悬浮细胞以中止酶解。
9. 清除细胞碎片：用细胞滤网（4070 μm）过滤细胞悬液，去除细胞碎片。
10. 培养神经干细胞：将过滤后的细胞悬液接种到带有神经干细胞培养基的培养皿中。
11. 培养神经干细胞：在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养神经干细胞。每 23 天换一次培养基。
注意事项：
保持所有器械、仪器和培养基无菌。
尽可能小心地操作，避免损坏组织。
酶解时间可能因大鼠的年龄和其他因素而异。优化条件以减少细胞损伤。
定期监测神经干细胞生长，必要时亚培养。
2、小鼠神经干细胞的分离及培养实验
小鼠神经干细胞的分离及培养实验
材料：810 周龄小鼠
无菌手术工具
培养基（DMEM/F12，B27，EGF，FGF）
神经干细胞培养基（NeurobasalA，B27，EGF，FGF）
组织培养板
显微镜方法：
1. 小鼠脑组织分离
对小鼠进行麻醉并安乐死。
移除颅骨并暴露大脑。
沿海马体和皮层边缘小心剪下大脑半球。
将脑组织转移到含有冰冷培养基的培养皿中。
2. 神经干细胞分离
将脑组织使用细胞解离剂（如胰蛋白酶）进行消化。
通过过滤网过滤细胞悬液，去除碎片。
使用离心机（200 x g，5 分钟）将细胞沉淀。
用培养基（DMEM/F12，B27，EGF，FGF）洗涤细胞。
3. 神经干细胞培养
将分离出的细胞重悬于神经干细胞培养基（NeurobasalA，B27，EGF，FGF）中。
将细胞接种到预涂有神经干细胞粘附培养基的组织培养板中。
每 34 天更換培养基。
4. 神经干细胞鉴定
使用免疫细胞化学染色法或流式细胞术鉴定神经干细胞。
常见的标记物包括 NESTIN、SOX2 和 GFAP。
5. 神经分化
培养足够时间后（通常为 714 天），神经干细胞可以转化成神经元、少突胶质细胞或星形胶质细胞。
通过添加不同的生长因子或培养条件来诱导分化。
注意事项：
保持无菌操作条件，以防止培养物污染。
避免过度消化，因为这会导致细胞损伤。
每隔几小时监测培养物，并根据需要更换培养基。
3、大鼠神经干细胞提取方法
大鼠神经干细胞提取方法
材料：大鼠胚胎（1416 天孕龄）
无菌器皿和工具
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)
胶原酶 IV
胰蛋白酶
DNase I
神经干细胞培养基
PolyLOrnithine 和层粘连蛋白
步骤：1. 胚胎解剖：在无菌条件下解剖怀孕 1416 天的大鼠胚胎，去除头部并将其置于 HBSS 中。
2. 脑组织分离：用剪刀小心地去除脑膜，然后分离大脑半球和脑干。
3. 酶解：将大脑组织切成小块，并放入含有胶原酶 IV 和胰蛋白酶的 HBSS 溶液中孵育 1530 分钟。轻柔地吹打组织，以促进酶的激活。
4. 机械解离：将酶处理过的组织用移液管吹打至形成悬浮液。加入 DNase I，以防止 DNA 粘连。
5. 过滤：通过 70 μm 滤网过滤悬浮液，以去除细胞团和碎片。
6. 离心：将滤过的悬浮液在 1000 x g 的速度下离心 5 分钟。
7. 重悬：用神经干细胞培养基重悬细胞沉淀。
8. 贴壁培养：将细胞悬液接种在涂有 PolyLOrnithine 和层粘连蛋白的培养皿中。
9. 培养：将细胞在 37°C、5% CO2 的条件下培养。神经干细胞会在 23 天内贴壁。
质量控制：
观察培养物形态，确保细胞具有神经干细胞典型特征，如两极性形态和神经突起。
通过免疫细胞化学染色，确认神经干细胞标记物，如 Nestin、Sox2 和 GFAP 的表达。
评估神经干细胞的增殖和分化潜能。
4、大鼠神经干细胞提取原理
大鼠神经干细胞提取原理
提取大鼠神经干细胞通常涉及以下步骤：
1. 材料准备：
大鼠胚胎或新生儿
无菌解剖器械
无菌培养器皿
培养基（含神经干细胞生长因子）
2. 组织采集：
对大鼠实施麻醉，并按照无菌技术进行剖腹。
根据需要的具体脑区，取出胚胎或新生儿的脑组织。
3. 组织消化：
将脑组织用含蛋白酶或胶原酶的培养基消化。
消化时间和温度根据组织类型而异。
4. 细胞悬浮和过滤：
机械捣碎消化后的组织，制备单细胞悬浮液。
通过细胞滤器过滤悬浮液，去除组织碎片。
5. 密度梯度离心：
将细胞悬浮液放在密度梯度离心液上，通过离心将神经干细胞与其他细胞分离开来。
神经干细胞通常位于密度梯度较低的层。
6. 细胞收集和扩增：
收集密度梯度离心后含神经干细胞的层。
将细胞接种到含神经干细胞生长因子的培养基中，并在适当的条件下培养。
7. 神经干细胞扩大和鉴定：
培养的神经干细胞将进行扩增。
通过免疫荧光染色或流式细胞术等方法鉴定神经干细胞，确认其表达神经干细胞特异性标志。
原理说明：
神经干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的干细胞类型。它们位于大脑内特定的神经发生区，例如嗅球、齿状回和基底神经节。
提取神经干细胞的原理是利用组织消化和密度梯度离心等技术，将神经干细胞与其他脑细胞分离开来。神经干细胞具有较低的密度，因此在密度梯度离心过程中会位于密度梯度较低的层。
培养条件对神经干细胞的生长和扩大至关重要。适当的培养基、生长因子和培养条件可以维持神经干细胞的自我更新能力和分化潜力。
