肿瘤干细胞如何冻存（如何鉴定肿瘤干细胞）

1、肿瘤干细胞如何冻存

肿瘤干细胞冻存步骤

1. 细胞收获

从肿瘤组织或培养物中收集肿瘤干细胞。

使用无血清培养基进行冲洗以去除任何残留的血细胞。

2. 细胞计数和活力测定

用血细胞计数仪或台盼蓝染色法计数细胞并确定活力。

3. 细胞悬液制备

将细胞悬浮在冻存液中，通常由以下成分组成：

胎牛血清（FBS）

二甲基亚砜（DMSO）

其他冷冻保护剂，如甘油或聚乙二醇

细胞悬液的最终浓度应为 110 x 10^6 个细胞/ml。

4. 逐级降温

将细胞悬液转移至冷冻管中。

逐级将细胞缓慢降温至 80°C，以防止冰晶形成。这通常通过将冷冻管放置在装有异丙醇的冷冻盒中，并将其逐渐冷冻至 80°C 来实现。

5. 液氮保存

将降温至 80°C 的细胞悬液转移至液氮罐中。

液氮温度为 196°C，可长期保存活细胞。

6. 升温

当需要使用细胞时，将冷冻管从液氮罐中取出并迅速升温至 37°C。

可以通过以下方法进行升温：

将冷冻管放入 37°C 水浴中

在 37°C 热板上解冻冷冻管

快速升温可减少细胞损伤。

7. 培养

将解冻的细胞培养在适当的培养基中。

培养基应含有生长因子和营养物质，以支持细胞生长。

注意事项：

冻存前，确保细胞处于对数生长期。

使用优质的冻存液并遵循正确的降温和升温程序。

储存冷冻管时，避免剧烈振荡或敲击。

定期监测细胞活力和冷冻管的完整性。

2、如何鉴定肿瘤干细胞

鉴定肿瘤干细胞的方法

1. 表面标记物

CD44+CD24/low: 乳腺癌

CD133+: 神经胶质瘤、肺癌

ALDH1A1+: 乳腺癌、结肠癌

CD90+: 肝癌、前列腺癌

Claudin 4+: 卵巢癌

2. 功能性测定

肿瘤球形成能力：将肿瘤细胞悬浮在无血清培养基中，形成球状的肿瘤球。

异种移植致瘤性：将肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，形成肿瘤。

培养依赖性：肿瘤干细胞对特定生长因子或细胞因子依赖性培养。

3. 基因表达谱

Oct4、Nanog、Sox2: 胚胎干细胞相关基因

Bmi1、Hmga2: 多效性相关基因

MDR1: 耐药性相关基因

4. 微流控分析

侧向迁移：肿瘤干细胞具有更高的迁移速度和侧向迁移能力。

磁珠捕获：利用抗体结合肿瘤干细胞表面标记物，进行磁珠捕获。

5. 结合多种方法

通常需要多种方法相结合才能准确鉴定肿瘤干细胞，提高特异性和灵敏度。

注意事项：

肿瘤干细胞的鉴定受肿瘤类型和异质性的影响。

不同的肿瘤干细胞表面标记物在不同肿瘤类型中可能存在差异。

肿瘤干细胞的功能性测定受培养条件和检测方法的影响。