提小鼠脂肪干细胞步骤（小鼠肝细胞的提取及培养实验）
- 作者: 王希柚
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、提小鼠脂肪干细胞步骤
提小鼠脂肪干细胞步骤
材料:小鼠
无菌环境
手术仪器（镊子、剪刀、止血钳）
无菌生理盐水
脂肪组织采集容器
培养基步骤:
1. 准备小鼠
给小鼠注射麻醉剂并腹腔造口。
用碘溶液消毒造口部位。
2. 暴露脂肪组织
用剪刀沿腹中线切开腹壁皮肤，露出皮下脂肪组织。
用镊子轻轻剥离脂肪组织，将其暴露出来。
3. 采集脂肪组织
用一个无菌容器收集约 12 克的脂肪组织。
小心不要污染脂肪组织。
4. 清洗脂肪组织
将脂肪组织用无菌生理盐水冲洗干净，去除血液和碎屑。
5. 消化脂肪组织
将脂肪组织转移到一个含胶原酶的消化缓冲液中。
在 37°C 下孵育 4560 分钟，以消化脂肪组织。
6. 过滤消化液
将消化液通过 100 微米过滤网过滤，以去除组织碎片。
7. 离心收集细胞
将过滤的消化液在 1200 rpm 下离心 10 分钟，以收集细胞。
8. 重悬细胞
用培养基重悬沉淀细胞，去除消化缓冲液。
9. 培养细胞
将细胞接种到培养基中并培养，以选择并扩增脂肪干细胞。
提示:整个过程应在无菌环境中进行。
使用干净的仪器和材料。
小心操作，避免损伤脂肪组织。
2、小鼠肝细胞的提取及培养实验
小鼠肝细胞的提取及培养实验
材料雄性小鼠（C57BL/6，812 周龄）
Leibovitz's L15 培养基
2% 小牛血清白蛋白 (BSA)
0.5% 胶原酶 IV
100 U/mL 青霉素链霉素
0.05% DNase I
Williams' E 培养基
10% 胎牛血清 (FBS)
步骤1. 动物处理
用乙醚或二氧化碳对小鼠实施安乐死。
用 75% 乙醇消毒小鼠的腹部。
2. 提取肝细胞
打开腹腔，小心取出肝脏。
在无菌条件下将肝脏放入含有 Leibovitz's L15 培养基和 2% BSA 的培养皿中。
使用手术刀将肝脏切成小块。
将肝脏小块转移到含有 0.5% 胶原酶 IV、100 U/mL 青霉素链霉素和 0.05% DNase I 的培养皿中。
在 37°C 搅拌孵育 30 分钟。
3. 过滤和离心
使用 100 μm 细胞筛网过滤细胞悬液。
以 500 × g 离心 10 分钟除去细胞碎片。
4. 洗涤和计数
用 Williams' E 培养基洗涤细胞两次。
以 500 × g 离心 5 分钟。
使用血细胞计数板计数细胞。
5. 培养
将细胞接种在含有 Williams' E 培养基和 10% FBS 的培养皿中。
将细胞置于 37°C、5% CO2 培养箱中培养。
培养基更换
培养 24 小时后，更换培养基。
随后每 23 天更换一次培养基。
细胞形态观察
使用显微镜观察细胞形态。健康的小鼠肝细胞呈多边形，有清晰的细胞核和细胞膜。
提示使用新鲜的小鼠肝脏进行实验。
保持无菌操作以防止污染。
小鼠肝细胞对培养条件很敏感，因此应仔仔细细地遵循协议。
培养时间可能取决于实验目的和培养条件。
3、大鼠脂肪间充质干细胞提取
大鼠脂肪间充质干细胞（ADSCs）提取
材料:大鼠（雄性或雌性，体重 200250 g）
无菌手术器械
无菌培养基和培养皿
胰蛋白酶消化液
红细胞裂解剂
离心机流式细胞仪（可选）
步骤:1. 大鼠麻醉和手术
麻醉大鼠：腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg 体重）。
固定大鼠：仰卧位固定在大鼠手术台或平面上。
消毒手术部位：用 70% 乙醇消毒大鼠腹部分。
打开切口：在腹部中线上切开 12 cm 的切口。
2. 脂肪组织收集
显露腹膜：小心打开腹膜，露出腹部的脂肪垫。
收集脂肪组织：使用无菌剪刀和镊子轻轻分离和收集 12 g 的脂肪组织。
将脂肪组织转移到无菌培养皿中。
3. 消化脂肪组织
加入消化液：向脂肪组织中加入 1015 ml 胰蛋白酶消化液。
孵育：在 37°C 恒温摇床上孵育 3060 分钟，每 15 分钟震荡一次。
4. 过滤和离心
过滤：将消化后的组织通过 100 μm 细胞滤网过滤，去除未消化的组织碎片。
离心：将滤过的细胞悬液以 300 x g 离心 10 分钟。
5. 红细胞裂解
加入红细胞裂解剂：向细胞沉淀中加入 12 ml 红细胞裂解剂。
孵育：在室温下孵育 10 分钟，每 5 分钟轻轻涡旋。
洗涤：再次以 300 x g 离心 10 分钟并丢弃上清液。
6. 培养
加入培养基：向细胞沉淀中加入 1015 ml 完整培养基（如 DMEM + 10% FBS）。
将细胞悬液转移到新的培养皿中。
培养：在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养细胞。
7. 纯化 ADSCs（可选）
贴壁培养：培养 ADSCs 4872 小时，允许 ADSCs 贴壁生长。
去除非贴壁细胞：轻轻倾倒培养基，去除悬浮细胞和未贴壁细胞。
流式细胞术分选：使用流式细胞仪根据特定的表面标记（如 CD90、CD29）分选 ADSCs。
预期结果:
从大鼠脂肪组织中成功提取出 ADSCs。
ADSCs 贴壁培养并表现出典型的干细胞形态。
纯化 ADSCs 的流式细胞术分析显示特定表面标记的阳性。
4、小鼠神经干细胞提取方法
小鼠神经干细胞提取方法
材料：68 周龄小鼠
无菌 dissecting 工具
无菌培养皿
完整培养基（如 Neurobasal? A 培养基，添加 B27、谷氨酰胺、抗生素）
培养基补充剂（如 EGF、FGF2）
0.25% 胰蛋白酶EDTA 溶液
神经干细胞标记物抗体（如 Nestin、GFAP）
步骤：1. 准备小鼠：对小鼠进行全身麻醉并处死。
2. 提取大脑：打开小鼠颅骨，小心取出大脑。将大脑放在无菌培养皿中。
3. 去除脑膜：使用无菌 dissecting 工具，小心地去除大脑上的脑膜层。
4. 解剖海马：识别海马体。小心地解剖并取出海马体。
5. 切碎组织：将海马体组织切成小块。
6. 胰蛋白酶消化：将组织块转移到含有 0.25% 胰蛋白酶EDTA 溶液的培养皿中。在 37°C 温箱中孵育 20 分钟，期间轻轻振荡。
7. 终止消化：添加等体积的完整培养基，终止消化。
8. 离心和重悬：离心细胞悬液，去除上清液。用完整培养基重悬细胞。
9. 过细胞：通过 40 微米过滤网过滤细胞悬液，去除细胞团和杂质。
10. 培养：将细胞转移到含培养基补充剂的完整培养基中。在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养细胞。
鉴定：使用神经干细胞标记物抗体（如 Nestin、GFAP）对培养的细胞进行免疫荧光染色，以确认神经干细胞的身份。
提示：严格无菌操作。
使用新鲜、健康的组织。
精确解剖，避免污染其他脑区域。
胰蛋白酶消化时间应优化，以获得最佳细胞活力。
定期更换培养基，并监测细胞生长。
