小鼠干细胞怎么培养（小鼠干细胞怎么培养 🦋 出来）
- 作者: 李南星
- 来源: 投稿
- 2025-02-27
1、小 🐠 鼠干细胞怎么 🐟 培养
鼠胚胎干细胞 🌾 培养
材料:鼠 🐅 胚胎 🌴 （9.513.5 dpc）
无血清 🌼 胚胎干细胞培 🐈 养基（DMEM/F12、20% FBS、1 mM 2巯 🐱 基乙醇、100 U/ml 青霉素、100 ug/ml 链霉素）
非活性化鼠胚胎成纤维细 🐋 胞（MEF）
0.25% 胰 🌻 酶/EDTA 溶液
明 🐞 胶包被 🦅 培养 🦆 皿
步骤:1. 收集胚胎 🐞 : 从 🐎 受孕雌性小鼠中取出 🌺 胚胎，放入无血清培养基中。
2. 去除内脏团: 使用 🌲 无菌解剖镊子 🕊 小心去除胚胎的内脏团（含心 🌿 脏和肝脏）。
3. 悬浮胚胎: 将胚胎转移到胰酶/EDTA 溶液中，在 37°C 下孵 🐴 育 15 分，钟以 🐶 消化细胞外基质。
4. 终 🦄 止消化: 加入无血清培养基，用移液管吹 🐎 打胚胎以解离细胞。
5. 过滤细胞悬液: 通过过 🐼 滤 40 μm 器过滤 🦁 细胞悬 🦄 液，去除未解离的细胞团。
6. 离心细 🌿 胞 🐞 : 将细胞悬液在 1,200 rpm 下离心 5 分钟。
7. 重悬细胞: 用无血清培养基重悬细胞 🪴 。
8. 接种细胞: 将细胞接种到预先铺设有非活性 🐅 化 🐬 MEF 的明胶包被培养皿中。
9. 培养: 在 🐡 37°C、5% CO2 的恒温箱中孵育细胞培养。基每 23 天。更换一次
10. 传代: 当细胞达到 7080% 融合时 🐒 ，可进行传代。使用胰 🕊 酶/EDTA 消，化细胞。并按照接种细胞的步骤重新 🕊 培养
提示:使用年轻的胚胎（9.513.5 dpc）获得最佳结 🐯 果。
仔细去除 🕸 内脏团 🦍 ，以避免内胚层细胞的污染。
使用高品质的无血清培养基，以避免血 🌳 清批次差异的影响。
非活性化 MEF 可提供基质 🌻 和生长 🐒 因子，支持胚 🐯 胎干细胞的自我更新。
培养基应每 23 天 💮 更换一次，以提供新鲜的营养物 🌲 质 🍁 并去除代谢废物。
定期监 ☘ 测细胞形态 🐯 ，以确保胚胎干细 🌷 胞保持未分化状态。
2、小鼠干细胞 🐒 怎 🦁 么培养出来
小 🦅 鼠干细 🐡 胞培养
材料：SPF 级 🐠 小鼠
无 🌴 菌 🐶 手术器械
PBS（磷 🐈 酸盐 🌺 缓冲液）
胶 🐶 原 🐶 酶 🦈 IV
胚胎干 🍀 细胞培养基（含 🌾 LIF）
6 孔 🕸 培养 🌾 板
细胞 🐋 刮刀
步骤：1. 胚 🌲 胎采集
对 SPF 级 🦄 小鼠实施 🌿 腹腔 🐺 手术
打 🐴 开腹腔，暴露子 🦋 宫
从子宫 ☘ 中取出 12.514.5 天的胚胎
2. 胚胎 🐳 解 🌿 剖 🐡
将胚胎 🌷 置于无菌培养皿中，用 PBS 洗涤
使用无菌剪刀 🐶 和镊子切开胚胎的胎盘 🐋 部分
取 🐳 出内细胞团（ICM），将其置于新的无菌培养皿中
3. 细 🌵 胞离解
加 🌹 入含有胶原 🦊 酶 IV 的培养基 🐧 ，轻轻吹打细胞
将细胞悬液转移到 15 毫升离心管中离心，分 🐬 5 钟，1000 x g
用 PBS 洗 ☘ 涤 🐋 细胞沉淀 🌷 两次，每次离心 5 分钟，1000 x g
4. 细胞 🕸 培 🐟 养 🐝
将细胞重悬于胚胎 🐝 干细胞培养基中
在预涂有明胶的 6 孔培养板 🌵 中接 🐛 种细胞悬液
每孔接种约 100200 个 🐎 细 🐝 胞 🐵
将培 🪴 养板 🐺 置于 37°C、5% CO2 的培养 🌼 箱中培养
5. 培养 🌹 基更换
每隔 🦍 23 天更换 🌳 培养基一次，加入新鲜的胚胎干细胞培养基
小心地吸出 🐺 旧培养基 🦊 ，避免吸走细胞
加入新鲜培养基，轻轻摇晃培养 🍀 板 🐡 促进混合
6. 细胞传代 🌷
当细胞 🦈 达到 7080% 的融合度时，可以传代
用细胞 🐯 刮刀 🐝 轻轻刮 🐛 下细胞
根据细胞数量进行分株，通常按照 1:2 或 💮 1:4 的比例传代
继续在 🕊 胚胎干细胞培养基中培养细胞 🐋
注意 🐺 事项：
整个过 🐱 程必 🌺 须在无菌条件下进 🌸 行
保持细胞培养环境稳定，避免温度和 🐟 CO2 浓度波动
定 🌿 期观察细胞状态 🌸 ，及时发现和 🌵 处理污染或分化
使用高品质的 🐴 培养基和试剂，确 🦅 保细胞的健康生长
3、小鼠 🌳 干 🌹 细胞怎么培养的
小鼠干细胞培养步 ☘ 骤：
材料：小 ☘ 鼠 🦊 胚胎（78.5 天大的受 🪴 精卵）
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
胎牛 🦊 血 🐟 清 🦢 (FBS)
白 🦅 血病抑制因子 (LIF)
2i 抑制剂 🐴 (PD 和 CHIR99021)
笔、培、养 🍁 、皿培养基移液器
CO2 培养 🪴 箱 (37°C，5% CO2)
步骤：1. 胚 🌾 胎 🌷 采集 🐈 ：
用消毒过的工具小心解剖怀孕小鼠 🦉 ，取出胚胎。
将胚胎 🐎 转移到 🌾 含 DMEM 的培养皿中 🌿 。
2. 内细胞 🦉 团分 🐕 离：
用无菌解剖刀将 🕊 胚胎内细胞团 (ICM) 与 💮 滋养层分离。
ICM 可通过其透明、圆形 🌳 的外观来 🌼 识别。
3. 培养 🐛 基 🐵 制备 🐛 ：
制 🐛 备包含 🐡 以下成分的基础培养基 🐅 ：
DMEM
15% FBS
1000 U/mL LIF
2i 抑 🦊 制 🦅 剂（1 μM PD，3 μM CHIR99021）
4. 培 🐧 养：
将分离后的 ICM 转移到含基础 🐡 培养基的培养皿中。
将培养皿 🐋 置于培 🦍 养 CO2 箱 🐕 中（37°C，5% CO2）。
每 23 天更换培 🦊 养基。
5. 分离和 🐵 传代：
当细胞长到 7080% 融合度时，用胰蛋 🦍 白酶消化细胞。
将细胞悬浮液重 🌲 新接种到含新鲜培养基的新培养皿中。
继续培 🕸 养和传代细胞，直至获得所需数量的干细胞。
提示：保持无菌条件以 🌴 防止 🦈 培养物受 🌸 污染。
经常监测细胞生长和 🐞 形态，以 🐕 确保细胞 🪴 健康。
LIF 和 2i 抑制剂 🦍 对于维持干细胞的未分 🦄 化状态至 🕊 关重要。
培养条 🐡 件可 🐒 能因不同的细胞系而异，需要进行优 🦈 化。
4、小鼠胚胎干细胞的培 🐝 养
小鼠 🐦 胚胎干 🐦 细 🐯 胞（mESCs）的培养
材料：无血清 🐞 培养基（例如：DMEM+LIF或2i）
胚胎干细胞级培养皿或 🌷 小瓶
mESCs
MEF细 🦋 胞 🐡 （可选 🌳 ）
0.25% 胰 🐯 蛋白 🌺 酶EDTA
10% 胎牛 🐝 血清（FBS）
步骤：1. 解 🦋 冻 🌲 mESCs
将 🐈 冷冻的mESCs在的37°C水 🍁 浴中快速解冻。
轻轻吹打细 🐈 胞悬液，加入5mL预热的无 🦁 血清培 🍁 养基。
将细胞悬液转移到 ☘ 15mL离心管中，在200x g下5离心分钟。
2. 重悬细胞 🦅 （可 🐶 选）
如果培养皿或小瓶中已经存在MEF细胞 🐟 ，可跳 🌲 过 🐕 此步骤。
除去上清液，用2mL无血清培 🌾 养基重悬细胞。
将细胞悬液均匀接种到 🐘 预涂有0.1% 明 🕷 胶的培养皿或小瓶中 🦉 。
3. 添 🐯 加MEF细 🐋 胞（可 🕷 选）
如果培养皿或小瓶中没有MEF细胞，则MEF需 🐡 要添加细胞。
轻轻吹打MEF细胞悬液，将 🌴 其均匀接种到mESC培养皿或小瓶中。
MEF细胞与mESC的比例 🐶 为 🐝 1:1。
4. 培 🐠 养 🐡
将培养皿或小瓶置于37°C、5% CO2的培 🐟 养箱 🌵 中 🐘 。
每 🌷 23天更换一半培 🦄 养基。
避免 🐺 剧烈搅动培养基，以免干扰 🐘 细胞 🐠 生长。
传代：当细胞达到7080%汇合度时 🐝 即可 🕸 传代。
用0.25%胰蛋 🌸 白酶 🐵 EDTA解离 🦄 细胞。
将细 🐕 胞悬液收集到15mL离 🌺 心管 🪴 中，在200x g下5离心分钟。
除去上清液，用无血清培养基重悬 🐱 细胞。
将细胞重新接种 ☘ 到新的培养 🕸 皿或小瓶 🦍 中。
提示：使用高品质无血清培养 🐞 基对于培养mESC至关重要。
定期检测培 ☘ 养基pH，将其保 🦍 持在7.27.4之间。
避免使用抗生素 🌴 ，因为它们会抑制mESC的生长。
定期检查mESC形态，确保 🦟 其保持未分化状态。
