小鼠如何检测肝脏干细胞（小鼠如何检测肝脏干细胞分离）
- 作者: 刘语现
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、小鼠如何检测肝脏干细胞
小鼠检测肝脏干细胞的方法
1. 基因表达标记
CD34：CD34 是表达在肝脏干细胞表面的一个跨膜糖蛋白，经常用于分离和鉴定这些细胞。
CD45：CD45 是一种白细胞标记，肝脏干细胞通常表达低水平的 CD45。
CD133：CD133 是一个跨膜糖蛋白，也在肝脏干细胞中表达。
EpCAM：上皮细胞粘附分子 (EpCAM) 是一种细胞表面糖蛋白，在肝脏干细胞中表达。
2. 功能性检测
克隆形成试验：分离的肝脏细胞在培养基中培养，形成克隆。肝脏干细胞能形成大量克隆，而其他类型的肝细胞不能。
造血抑制/小鼠接受抑制血液细胞生成剂量的辐射或化疗。随后分析肝脏组织以评估干细胞再生肝脏组织的能力。
3. 肝小管形成
培养基质培养：肝脏干细胞在培养基质上培养，形成管状结构，称为肝小管，类似于肝脏组织中的结构。
4. 动物模型
肝脏损伤模型：通过化学或手术方法对小鼠模型造成肝脏损伤。随后分析肝脏组织以评估干细胞对损伤的反应和再生能力。
移植模型：将分离的肝脏干细胞移植到免疫缺陷小鼠模型中。移植的干细胞可以在小鼠体内分化并形成功能性肝脏组织。
5. 其他方法
荧光激活细胞分选 (FACS)：使用荧光标记的抗体分离和鉴定肝脏干细胞。
单细胞 RNA 测序：分析单细胞的基因表达谱，识别肝脏干细胞亚群和它们的特征。
2、小鼠如何检测肝脏干细胞分离
小鼠肝脏干细胞分离检测方法
免疫表型分析
使用流式细胞仪检测特定标记物，如 Sca1+、cKit+、CD45、EpCAM。
这些标记物可以区分肝脏干细胞与其他肝细胞类型。
克隆形成分析
将分离出的细胞接种到基质胶或培养基中，形成克隆。
通过检测克隆形成的数目和大小来评估肝脏干细胞的自我更新能力。
分化潜能分析
将分离出的细胞分化成肝细胞、胆管细胞或胰腺细胞。
通过免疫组化、RTPCR 或功能分析来评估分化潜能。
体内移植分析
将分离出的细胞移植到小鼠体内，诱导肝脏再生或修复。
通过检测移植细胞的存活、增殖和分化来评估肝脏干细胞的再生能力。
其他方法体内标记法：使用特定病毒或转基因系统在体内标记肝脏干细胞。
细胞排序：使用荧光激活细胞分选（FACS）或磁性活化细胞分选（MACS）对肝脏干细胞进行排序。
单细胞RNA测序：分析单个肝脏干细胞的转录组，以识别其独特的分子特征。
具体操作步骤：
1. 肝脏组织采集：从小鼠肝脏中分离肝细胞。
2. 细胞消化：使用酶促法消化肝细胞，将它们解离成单细胞悬液。
3. 免疫标记：使用特异性抗体标记肝脏干细胞。
4. 细胞分选：使用流式细胞仪或其他分选方法分离标记的细胞。
5. 鉴定和分析：使用免疫表型分析、克隆形成分析、分化潜能分析或其他方法来鉴定和表征分离出的肝脏干细胞。
3、小鼠肝细胞的提取及培养实验
小鼠肝细胞的提取及培养实验
目的本实验旨在提取小鼠肝细胞并将其培养在体外，用于后续分化、功能或毒性研究。
材料动物
雄性 C57BL/6 小鼠 (68 周龄)
培养基和试剂
无血清肝细胞培养基
肝细胞生长因子 (HGF)
白蛋白 (BSA)
胶原酶 IV
HBSS (无钙/镁)
Leibovitz's L15 培养基
0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液
设备生物安全柜
无菌手术器械
培养皿和培养瓶
离心机血细胞计数器
倒置显微镜
实验步骤
1. 肝脏提取
1. 将小鼠处死并分离出肝脏。
2. 在无菌条件下，切除胆囊和任何可见的脂肪组织。
3. 用预冷的 HBSS 冲洗肝脏。
2. 肝细胞分离
1. 将肝脏切成小块 (约 1 毫米)。
2. 在含有 100 U/ml 胶原酶 IV 和 2% BSA 的 HBSS 中孵育肝块 30 分钟，37°C，摇晃。
3. 通过 70 μm 细胞滤网过滤悬浮液，收集细胞。
4. 用 Leibovitz's L15 培养基洗涤细胞两次。
3. 肝细胞培养
1. 将肝细胞悬浮在含有 HGF (20 ng/ml) 和 BSA (0.1%) 的无血清肝细胞培养基中。
2. 将细胞接种到培养皿或培养瓶中，密度为 50,000100,000 个细胞/cm2。
3. 在 37°C、5% CO? 培养箱中培养细胞。
4. 细胞传代
1. 当细胞长到 8090% 融合时，用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 溶液处理它们。
2. 收集细胞并根据上述方法重新悬浮和培养。
预期结果
肝细胞提取后应存活并具有正常的形态。
培养 24 小时后，肝细胞应附着在培养皿上并开始伸展开来。
细胞应在体外培养中存活至少 7 天。
注意事项
本实验需要在无菌条件下进行。
肝细胞对温度和机械应激敏感，因此在整个实验过程中应小心处理。
HGF 是肝细胞培养不可缺少的生长因子。
定期监测细胞并根据需要更换培养基。
定期使用血细胞计数器监测细胞活力和增殖。
4、小鼠如何检测肝脏干细胞移植
小鼠如何检测肝脏干细胞移植
1. 活体成像：
荧光素酶报告系统：移植的干细胞可以改造为表达荧光素酶，该酶使生物发光。通过体内成像技术，可以监测细胞移植的定位和存活情况。
生物发光成像：类似于荧光素酶报告系统，但使用的是生物发光素酶，可产生稳定且高效的生物发光。
2. 免疫组化：
免疫荧光染色：使用针对肝脏干细胞特异性标记物的抗体，可在移植物组织切片中检测到移植的细胞。
免疫组织化学染色：与免疫荧光染色类似，但使用色素沉着剂或酶底物来可视化抗体结合。
3. 分子分析：
实时 PCR：用于量化移植物中移植干细胞特异性 mRNA 水平。
宏基因组测序：可识别移植物的独特转录物特征，从而区分供体和受体细胞。
4. 细胞追踪：
微粒注射：向移植干细胞中注射荧光微粒或量子点，以便在体内追踪细胞命运。
标记病毒：使用表达荧光蛋白或生物发光蛋白的标记病毒感染移植干细胞。
5. 功能评估：
生理功能测试：包括肝脏功能测试（例如，血清酶水平、凝血时间）和影像学检查（例如，超声波、计算机断层扫描），以评估移植干细胞的肝功能恢复程度。
细胞分化标记物：检测移植干细胞中肝细胞特异性标记物（例如，白蛋白、细胞角蛋白 18）的表达，以评估细胞分化。
6. 其他方法：
流式细胞术：用于分离和鉴定移植干细胞，基于其表型特征和荧光标记。
X 线照相术：使用对比剂增强移植细胞，以便在 X 射线上进行追踪。
PET 成像：使用放射性同位素标记的葡萄糖或其他代谢物，以监测代谢活跃的移植细胞。
