小鼠肠道干细胞提取（骨片法提取小鼠间充质干细胞）
- 作者: 郭北棠
- 来源: 投稿
- 2025-01-02
1、小鼠肠道干细胞提取
小鼠肠道干细胞提取
材料：68 周龄的 C57BL/6J 小鼠
无菌手术器械
70% 乙醇
冷 PBS
5 mM EDTA
克罗恩氏酶（Dispase II）
Leibovitz's L15 培养基（添加 1% FBS）
DMEM/F12 培养基（添加 10% FBS、1x B27、1x N2、1 mM N乙酰葡糖胺）
步骤：1. 小鼠安乐死和肠道切除：
将小鼠安乐死，用 70% 乙醇擦拭腹部。
在腹腔中线切开，取出生殖腺周围的肠段。
2. 肠段清洗：
在冷 PBS 中冲洗肠段，去除粪便和残留物。
用 5 mM EDTA 处理肠段 30 分钟，去除黏液层。
3. 酶解：
将肠段切成小块，在含有克罗恩氏酶 (0.8 mg/mL) 的 Leibovitz's L15 培养基中消化 60 分钟，37°C。
4. 过滤和离心：
将消化后的组织物通过 70 μm 细胞筛网过滤。
在 1,200 rpm 下离心 5 分钟，收集沉淀物。
5. 细胞培养：
将沉淀物重悬于 DMEM/F12 培养基中。
将细胞接种到预涂有 Matrigel 的培养皿中，37°C、5% CO2 孵育。
细胞表征：
要确认分离出来的细胞是肠道干细胞，可以进行以下表征：
标记表达： 免疫荧光染色或 FACS 分析检测 Lgr5、Bmi1 或 Sox9 等肠道干细胞标记。
克隆形成： 将分离的细胞铺板，形成克隆，观察克隆的大小和形态。
分化潜力： 将分离的细胞分化成肠系膜和肠上皮细胞，以证明其多能性。
2、骨片法提取小鼠间充质干细胞
骨片法提取小鼠间充质干细胞（MSCs）
材料和设备
小鼠脊椎
无菌手术器具
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) 培养基
胎牛血清 (FBS)
抗生素抗真菌混合物
平板培养板或培养瓶
培养箱步骤
1. 采集小鼠脊椎：
处死小鼠并取出脊椎。
用无菌手术器具清除脊椎上的肌肉和结缔组织。
2. 将脊椎切成小片：
使用手术刀将脊椎切成 12 mm 厚的小片。
3. 骨片消化：
将骨片转移到含胶原酶 II 或胶原酶 IV 的酶溶液中。
在培养箱中 37°C、5% CO2 条件下孵育 24 小时。
每隔 3060 分钟搅拌一次。
4. 分离 MSCs：
通过 70 μm 细胞滤网过滤消化后的溶液，收集细胞悬浮液。
向细胞悬浮液中加入含有 FBS 和抗生素抗真菌混合物的 DMEM 培养基，进行离心（200 x g，5 分钟）。
弃去上清液，重悬细胞。
5. 培养和扩增 MSCs：
将细胞接种于预先涂层的培养板或培养瓶中。
在 37°C、5% CO2 条件下培养。
每 34 天更换培养基。
当细胞达到 8090% 融合时，进行传代。
注意：使用无菌技术进行整个过程。
使用新鲜的小鼠脊椎，避免冷冻和解冻。
优化酶溶液的浓度和孵育时间以获得最佳的细胞产率和活力。
定期监测培养物并更换培养基以保持细胞的健康状况。
3、小鼠骨髓间充质干细胞提取
小鼠骨髓间充质干细胞提取
材料：68 周龄小鼠
70% 乙醇
碘伏DPBS（无钙镁）
RPMI1640 培养基
10% FBS
青霉素/链霉素（100 U/mL）
25G 针头
60 mm 培养皿
细胞计数板
T25 培养瓶
步骤：1. 小鼠制备：
将小鼠麻醉。
消毒小鼠腹部。
2. 骨髓抽出：
用 25G 针头刺入小鼠股骨或胫骨。
抽出 0.51 mL 骨髓液。
3. 骨髓液处理：
将骨髓液转移到 60 mm 培养皿中。
加入相等体积的 DPBS 稀释。
缓慢加入 3 mL RPMI1640 培养基，同时轻轻吹打混匀。
4. 密度梯度离心：
将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中。
在底部加入 4 mL Percoll（比重 1.077）。
缓慢离心 40 分钟，2000 × g，室温。
5. 间充质干细胞收集：
小心的吸取层状带（位于 Percoll 和培养基界面）中的细胞。
用 RPMI1640 培养基洗涤细胞 2 次（1200 × g，5 分钟）。
6. 细胞培养：
将细胞悬液接种到 T25 培养瓶中，每瓶加入 10 mL 培养基（RPMI1640 + 10% FBS + 青霉素/链霉素）。
37°C，5% CO2 培养。
注意：保持无菌操作。
轻柔处理细胞以避免损伤。
定期更换培养基（每 34 天）。
间充质干细胞通常在培养 710 天后贴壁。
贴壁后，可分离细胞用于进一步实验。
4、小鼠脂肪间充质干细胞提取
小鼠脂肪间充质干细胞（iASCs）提取
材料：24 周大的小鼠
PBS（磷酸盐缓冲液）
胶原酶 IV
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
胎牛血清 (FBS)
青霉素链霉素
胰蛋白酶EDTA
步骤：1. 屠宰小鼠：
以适当的方式屠宰小鼠。
用 70% 乙醇对腹部区域进行消毒。
2. 脂肪组织摘除：
用剪刀和镊子仔细摘除腹部的脂肪垫。
将脂肪组织转移到盛有冷 PBS 的无菌培养皿中冲洗。
3. 脂肪组织消化：
将脂肪组织转移到含有胶原酶 IV（1 mg/ml）的无血清 DMEM 中。
将培养皿置于 37°C 的摇床中孵育 30 分钟。
间歇性摇晃以促进消化。
4. 酶消化终止：
用含有 10% FBS 的 DMEM 终止消化。
小心不要搅拌，因为这会破坏细胞。
5. 细胞过滤：
将消化液通过 100 μm 滤网过滤以去除未消化组织。
将滤液收集到一个新的无菌离心管中。
6. 离心：
以 300 x g 转速离心 10 分钟。
弃去上清液，保留沉淀。
7. 红血球溶解（可选）：
如果存在大量红血球，则使用红血球溶液进行溶解。
按照制造商说明进行操作。
8. 重悬并培养：
用含有 10% FBS 和青霉素链霉素的 DMEM 重悬细胞。
将细胞接种到培养瓶中并置于 37°C、5% CO2 的培养箱中培养。
细胞鉴定：
提取后，可以通过流式细胞术或免疫组织化学对 iASCs 进行鉴定。
iASCs 通常表达 CD29、CD34、CD44 和 CD90 等间充质标记物。
