脐带干细胞稳定培养（脐带间充质干细胞 🐬 培养方法流程图）
- 作者: 朱宁希
- 来源: 投稿
- 2025-03-23
1、脐带 🐋 干 🐶 细胞稳定培养
脐 🕸 带 ☘ 干细胞稳 🦅 定培养
简介脐带干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新和分化成各种细 💐 胞类型的能力 🐎 。稳。定培养脐带干细胞对于研究其特性和潜力以及开发基于细胞 🍀 的疗法至关重要
培养条件基本培养基：富含营养物 ☘ 质的培养基，例如 🌷 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 或 RPMI1640
血清：通常使用胎牛血清 (FBS) 作为补充，因为它含 🌼 有生长因子和激素
生长因子：例如表皮生长因 🐛 子 (EGF) 和成纤维细胞生长因子 (FGF)，可 🐘 以刺激干细胞增殖
抑制因子：例如 TGFβ，可以抑制干细胞分化 🐅
无微生物环境：使用抗生素和抗真菌剂 🦄 防止污 🌴 染 🐛
培养方法贴壁培 🪴 养：
干细 🪴 胞贴附在 🦋 涂 🦍 有胶原蛋白或层粘连蛋白的培养皿表面。
培养基 🦁 中含有 EGF 或 FGF 等生 💐 长因子。
悬浮 ☘ 培 🐒 养 🐒 ：
干细 🐛 胞 🌹 在搅拌 💮 生物反应器中悬浮生长。
培养基中含 🕷 有抑 🦊 制分化的因子，例 🐼 如 TGFβ。
稳定 🐞 培 🐝 养的挑战 🐧
分 ☘ 化：干细胞可能随着培养时间的延长而分化 🐦 ，失去 🐅 多能性。
衰老：干细胞在体外培养时会逐渐失去增 🐳 殖能力。
污 🌲 染：培 🕸 养物可能被细 🐬 菌或真菌污染。
遗传不稳定性： prolonged 培养会 🦄 导致 🐝 遗传变化。
克服挑战优化培养条件：调整生长因 🕷 子、抑制因子 🌺 和其他成分的浓度以促进稳定培养。
定期传代：将干细 🐕 胞定 🐅 期移 🌻 动到新鲜培养基中，以防止衰老和分化。
严格的质量控 🐱 制：监测培养物以检查污染和遗传不稳定性。
使用 🌼 低氧培养低氧：条 🌺 件已被证明可以 🌵 改善稳定培养。
应用稳定的脐带干细 🌾 胞培养已用于：
研究干细胞生物学和分化 🌳 潜力 🐧
开发基于细胞的疗法，例如再 ☘ 生医学 🐋 和癌症治疗
储存干细胞用于自 🐴 体或异体移 💮 植
2、脐带间充质干细胞培养方法流 🐯 程图
脐带间充 🦟 质干细胞培养方法流程图
采集脐带无菌采集并 🦍 运输新鲜脐带
组织加工移除血管 💐 和羊膜 🐒
细胞分离酶 🌵 消化（胶原 🐯 酶 🦅 IV）
过滤 🐼 去除 🕊 组织碎 🦊 片
贴壁培养将细 ☘ 胞悬 🌼 液接种 🌷 到培养瓶中
加入富含血清的培养基（例如 🌾 DMEM）
细胞增殖培养细 🐒 胞 710 天直至 🐕 8090% 融合
定期换液以提 🌷 供新鲜营养物
传代使用胰蛋白酶 🕷 消化 🦊 细胞
扩 ☘ 增传 🐴 代 🌻 细胞
鉴定和 🐈 表征 🐟
表型分 🦉 析：流 🕊 式细胞仪检测 CD105、CD73、CD90 等标志物
分化潜能：向 🐕 脂肪、骨和软骨 🌷 分化
冻存 🦈 和 🦄 复苏 🐳
使用二甲基亚 🌸 砜冻 🦁 存细胞
在 🍀 需要 🪴 时复苏细胞 🌳
3、脐 🐈 带间充质干细胞培养方法
脐带 🦉 间充 🌻 质干细胞培养方法
材料：新 🦍 鲜 🐡 脐 💐 带
PBS胶 🦊 原 🌺 酶 🌺 I
培养基（如 🕷 DMEM/F12）
胎 🐬 牛 🐎 血清 🌵 (FBS)
抗生素和抗真 🕷 菌剂
步骤：1. 脐带采 🦢 集和处理：
从脐带血库或产 🐱 妇处 🕷 采集新鲜脐带。
用 PBS 冲洗脐带以去 🦢 除 🐶 血液。
将脐 🐺 带切成约 2 厘米的片 🐛 段。
2. 消化 💐 ：
将脐带片段放入 🐛 含 0.2% 胶 🦟 原酶 I 的 PBS 溶液 🐅 中。
37°C 孵育 🦍 3060 分钟 🌼 ，定期搅 🕸 拌。
用 PBS 洗涤消化 🐯 后的组织 3 次，以 🐱 终止酶活性 🌷 。
3. 悬浮细 🐯 胞 💐 收 🐺 集：
将消化后的组织过滤通过 🐅 100 μm 细胞滤网，收 🕷 集单细胞悬液。
用 🐈 PBS 洗涤细胞 2 次 🐶 。
4. 细胞培养 🐡 ：
将细胞 🌺 悬液接种到含有 10% FBS、抗生素和抗真菌剂的 🦄 培养基 🦅 中。
37°C、5% CO2 条件下培养细 🦋 胞 🐧 。
每 23 天更 🦋 换培养 🦁 基 🐝 。
5. 细 🦆 胞 🦄 贴 🕸 壁：
细胞贴壁后（通常需要 714 天），将非贴壁细胞小 🐯 心地吸除。
继续用 🐋 新鲜培养基培养贴壁细 🪴 胞 🐝 。
6. 扩 💮 增和传代：
当细胞达到 7080% 汇合 ☘ 度时，进行传代。
用胰蛋 🕸 白酶消 🕸 化贴壁细胞，并将其接种到新鲜培养基中。
可以重 🐅 复传代细胞以扩大细胞数量。
7. 表 🐺 型 🐺 鉴定 💐 ：
使用流式细胞术或免疫染 🪴 色等方法鉴定细胞表面 🐯 标记 🍁 ，如 CD29、CD44、CD73 和 CD90，以确认间充质干细胞身份。
注 💐 意事项：
保持 🐕 无菌条件 🐎 至 🦈 关重要。
优化培 🦢 养条件（例如培养基类型、生长因子和传代频率）对于获得高质量 🐯 的脐带间充质干细胞 🕊 至关重要。
脐带 🐺 间充质干细胞可能具有变异性，因此需要在使用前进 🐼 行表型鉴定和功能 🐺 测试。
4、脐带 🐕 间充质干细 🐛 胞原代培养
脐带间充质干 🌷 细胞原代 🌺 培养
材料新鲜脐带有组织 🐛
基底培养 🦁 基 🐵 （例如 αMEM 或 🌲 DMEM）
胎 🐼 牛血 🌻 清 🐶 （FBS）
抗生素（例如 🌼 青霉素链霉素或庆大霉素）
抗真菌剂（例 🕸 如两性霉素 B）
胰蛋白 🦍 酶 🕊
玻 🌾 璃或塑料培 🐺 养皿
步骤1. 脐带组织收 🐦 集
从新生儿分娩后收集脐 🌺 带。
用生理盐水冲洗脐带，去除 🌳 血液和 🌸 羊水 🐵 。
2. 消毒和 🌳 切割 🐕
用 70% 酒 🌼 精对脐带进行消毒。
使 🦆 用无菌剪刀将脐带剪成小块（约 1 cm3）。
3. 组 🦈 织消 🕷 化 🐛
将脐带块转移到含有胰蛋白 🐞 酶溶液的培养皿中。
孵育 13 小 🐋 时，37°C，轻轻摇动。
消化后，用 🐈 基底培 🐋 养基终止消化。
4. 离心和收集细 🦉 胞 🐘
将细胞 🕊 悬液离心 5 分钟，500 x g。
去除上清液并用新鲜基底培养 🐠 基重悬细胞。
再次 🪴 离 🐴 心 🦄 5 分钟，500 x g。
5. 播 🐬 种和培养 🐼
将细胞悬液播种到 🦁 玻璃或塑料培养皿中，浓度 🐎 为 12 x 10? 个细胞 🕸 /cm2。
在 💮 37°C、5% CO? 培 🐠 养箱中培养 🦈 细胞。
6. 培 🐡 养 🌷 基更换
每 23 天更换 🐯 一半培养基。
使用含有抗生素和抗 🐋 真菌剂的新鲜基 🌵 底 🐵 培养基。
7. 细胞分化 🌺
细 🌸 胞通常在 714 天内贴壁生长 🌹 。
培养 34 周后，细胞将分化成形态特征性且表达间充质干细胞标记（如 CD90、CD105 和 🍁 CD73）的间充质干细胞样细胞。
提示使用新 🦍 鲜脐带组 🐕 织对于成 💐 功培养至关重要。
严格遵 🐡 循无菌技术 🌷 以防止污染。
优 🐯 化胰蛋白酶消化条件（时间、温、度浓度）以获得最佳细胞产量。
定期监测细胞生长和形态 🕷 ，必要时进行传代。
对培养的 🦟 细胞进行鉴定以确认 🌴 其间充质 🐒 干细胞特性。
