山西原代干细胞培养 🐶 技巧（脂肪干细胞原代培养）
- 作者: 朱学屹
- 来源: 投稿
- 2025-02-07
1、山西原代干 🌳 细 🐅 胞培养技巧
山西原代干细胞培养技 🦆 巧
材料 🌺 和 🌼 试剂 🌼
原代 🌼 干 🌳 细 🐘 胞悬液
基 🌳 础 💐 培养基：DMEM/F12 或培养 🦋 基 RPMI 1640 含， 10% FBS
传代培养基基：础培养 🪴 基，含 🐈 20% FBS
抗生素抗 🍀 /真菌药溶 🐎 液：青/霉素链霉素或其他合适 🐞 的抗生素
培 🐳 养皿或 🐺 培养瓶
细胞 🐛 分离液 🐵 （可选）
细 🌿 胞计数 🦢 器
冻存液操作步骤
1. 原 🐯 代干细胞的获取和分离
从适当的组织源 🐠 头 🌴 获取新鲜组织样品 💮 。
将组 🕷 织样品切碎或 🐝 研磨成小块 🐯 。
使用细胞分 🌳 离液 🌾 （可选）或机械方法分离细胞。
收集细胞 🐡 悬液并离心除去上清液。
2. 细胞悬液的重 🐎 悬
用基础培 🐅 养基重悬细胞沉 🌵 淀。
通过细胞计数器计数 🐝 细胞数量。
3. 细胞 🐧 播种
将适当数量的细胞接种到培养皿或培养 🐞 瓶中。
每平方厘米 🐝 约接种 25,00050,000 个细胞 🦢 。
4. 培 🌹 养条件
将细胞培养在 🐘 37°C、5% CO2 的潮湿环境中。
每隔 23 天更换培 🕊 养基。
5. 传代 🐋
当细胞达到约 80% 的 🌿 汇合度时，即可 🌵 进行 🌻 传代。
吸出 🐛 旧培养基，用传代培养基清洗细胞。
添加 🌹 适量胰蛋白酶EDTA 溶液，在 37°C 孵育 510 分，钟以解除细胞之 💮 间的粘附 🦍 。
加入传代培 🌳 养基 🐛 终止胰蛋 🐠 白酶活性。
将 🐺 细胞悬液离心并重悬，之后按照第 3 步进行细胞播种。
6. 冻 🌳 存 ☘
收集 🐴 处于 💐 对数生长期的细 🐅 胞。
离 🐠 心除去培养 🌸 基，用 ☘ 冻存液重悬细胞。
根 🐛 据制造商的说明，将 🕊 细胞悬液转移到冷冻管中 🐠 。
将冷冻管放入 80°C 冰箱中至少 🐅 24 小时，然后再转移到液氮罐中长 🦋 期保存。
注意事项使 🦅 用无菌技术进行所有操作。
确保培养基和试剂新 🦅 鲜。
定 🌹 期监测细胞形态和 ☘ 生长状况。
根据细胞类型调整 🌴 培 🌳 养条件和传代时间。
严格遵循 🐶 冻存和解 🌲 冻程序，以确保细胞活力。
2、脂肪干细 🐝 胞原代培养
脂肪 🐘 干细胞原代培养
1. 材 🌲 料 🐵
新 🦁 鲜脂 💐 肪 🌴 组织
专 🪴 用培养基（DMEM/F12 或 🕷 其他 🐎 ）
抗生素（青霉 🦄 素/链 🐶 霉素）
抗真菌剂（两性霉 🦢 素 B）
胶 🐎 原酶 I 或 🪴 II
胰 🕊 蛋 🐞 白酶
细胞分离 🌵 培养基 🐈 （PBS）
培养 🦄 皿或培 🐵 养 🌻 瓶
细 🐒 胞计 🌴 数板和显微镜 🪴
无菌操作设备 🕸 （例如超净工作台、移液枪）
2. 组织采 🐺 集 🐟
在无 🦋 菌条件下 🐛 ，从供体中采集新鲜脂肪组织样品 🌸 。
去除多余的组织和血液 🦄 。
3. 组 🌿 织 🦉 消 💮 化
用 PBS 洗涤 🦋 脂肪组织以去除 🌺 杂 🦢 质。
剪碎脂肪组织并将其放入装有消化酶溶液（例如 💐 胶原酶或胰蛋白酶）的消化瓶中。
在 37°C 下搅拌培 🐒 养 3060 分钟。
4. 细胞 🌼 分 🐳 离
消化后，通过过 100 μm 滤 🌲 ，器过滤细胞悬液以去除未消化的大碎片。
使用离心机在 300 x g 下 🌳 离 🦆 心 5 分钟。
小 🐱 心弃去上清液，并 🐦 用 🐬 PBS 重悬细胞沉淀。
5. 去 🐱 红细 🦄 胞 🌹
为了去除红细胞杂质，在细胞悬 🌵 液中加入红细胞 🐱 溶解 🦅 缓冲液。
在室 🌴 温下孵育 🕷 510 分钟。
用 PBS 洗涤细胞 🐡 并离心以去除溶血 🐈 缓冲 🐳 液。
6. 培 🌺 养 🐠
将 🌵 分离的细胞重悬在专用培养基中。
接种细胞至 🦊 培养皿或培养瓶中。
在 37°C、5% CO2 饱和湿润条 🦅 件下培养 🐵 细胞。
7. 培 🐒 养基更换 🍀 和细 🐝 胞传代
定期更换培养基（每 🌼 23 天一次）以提供营养并去除废物。
当细胞达到 8090% 的汇合度时，进行 🦋 细胞传代 🦅 。
将培养基 🐟 吸 🦊 出，用 PBS 洗涤细胞。
加入胰蛋白酶 🦈 消化 🌻 细 🌾 胞，并在培养箱中孵育直至细胞从基质上脱落。
用专用培养基稀释细胞悬 🐳 液，并接 🐡 入新的培养容器中。
8. 细 🍁 胞 🦊 鉴定 🦆
通过免疫表 🐕 型和分化实验对培养的脂肪干细胞进行鉴定 🐼 。
常见的分 🐘 化指标包括 🐅 成 💐 脂细胞、软骨细胞和成骨细胞。
