大鼠肌腱干细胞诱导分化（大鼠骨髓间充质干细胞提取）
- 作者: 杨文烁
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、大鼠肌腱干细胞诱导分化
大鼠肌腱干细胞诱导分化
大鼠肌腱干细胞（TRSC）是多能干细胞，存在于肌腱组织中。它们具有向肌腱细胞分化的能力，使其成为肌腱再生和修复的有前途的来源。诱导分化是体外操纵TRSC以定向使其变成肌腱细胞的过程。
方法常用的诱导分化方法包括使用以下因素：
生长因子：例如TGFβ1和BMP12，可促进肌腱细胞分化。
机械力：例如张力和压缩，可模拟肌腱中的机械环境。
生物材料：例如胶原蛋白和纤维蛋白支架，可提供适当的基质，支持TRSC向肌腱细胞分化。
步骤典型的诱导分化协议包括以下步骤：
1. 提取TRSC：从大鼠肌腱组织中提取TRSC。
2. 培养TRSC：在富含生长因子的培养基中培养TRSC。
3. 诱导分化：将TRSC暴露于诱导分化因子。
4. 培养诱导的肌腱细胞：在适当的基质上培养诱导的肌腱细胞，以促进其成熟和组织形成。
应用诱导分化的TRSC在以下应用中具有潜力：
肌腱修复：用于修复受伤或退化的肌腱组织。
肌腱工程：创建用于重建肌腱的新型生物材料。
药物筛选：评估对肌腱再生和修复有潜在影响的候选药物。
结论诱导分化大鼠肌腱干细胞为肌腱再生和修复提供了新的机会。通过优化诱导分化条件，可以大规模生产功能性肌腱细胞，用于临床应用和研究。
2、大鼠骨髓间充质干细胞提取
大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）提取
材料：68 周龄雄性 SpragueDawley 大鼠
70% 乙醇
PBS（pH 7.4）
DMEM/F12 培养基（含 10% FBS，1% 青霉素链霉素）
胰蛋白酶EDTA 溶液（0.25% 胰蛋白酶，0.02% EDTA）
流式细胞术抗体（抗 CD90、抗 CD34、抗 CD45）
梯度离心液（FicollPaque PLUS）
步骤：1. 伦理批准和动物处理
获得研究机构的伦理批准。
根据机构指南处理动物。
2. 大鼠处死和股骨取出
将大鼠处死并浸泡在 70% 乙醇中。
用无菌技术取出股骨。
3. 骨髓移除
用无菌 PBS 冲洗股骨。
将股骨的两端剪断。
用 10 mL 注射器和 20 号针头冲洗骨髓进入无菌培养皿中。
4. 红细胞溶解
将骨髓细胞悬液转移到含 10 mL 0.83% 氯化铵溶液的 50 mL 离心管中。
4°C 下孵育 10 分钟，每 5 分钟混匀一次。
4°C，1500 rpm 下离心 5 分钟。
弃去上清液。
5. BMSCs 分离
a. 梯度离心
将细胞悬液重悬于 10 mL PBS 中。
将细胞悬液小心地分层在 15 mL FicollPaque PLUS 上。
400 x g，25°C 下离心 30 分钟。
收集中间层（单核细胞层）并转移到新离心管中。
用 PBS 补足至 50 mL。
b. 培养
4°C，1500 rpm 下离心 5 分钟，弃去上清液。
将细胞重悬于 DMEM/F12 培养基中。
将细胞种子到培养皿中（1 X 10^6 个细胞/mL）。
在 37°C，5% CO2 条件下培养。
6. BMSCs 扩增
每 34 天更换一次培养基。
当细胞长到 80% 密集时传代。
用 0.25% 胰蛋白酶EDTA 溶液消化细胞。
以 1:2 或 1:3 的比例传代细胞。
7. 流式细胞术分析
在培养 12 周后收集细胞。
用 5% BSAPBS 孵育细胞以封闭非特异性结合部位。
用抗 CD90、抗 CD34 和抗 CD45 抗体孵育细胞。
用流式细胞仪分析细胞。
预期结果：
获得纯化的 BMSCs 群体。
流式细胞术分析应显示高水平的阳性标记物 CD90，以及低水平的造血标记物 CD34 和 CD45。
3、小鼠脾细胞的提取与分离
材料和设备
注射器（5 mL）和针头（25 号）
70% 乙醇
无菌 PBS
DMEM 或 RPMI 培养基
离心机细胞计数器
细胞培养瓶或微孔板
步骤1. 准备小鼠
对小鼠实施人道安乐死。
2. 提取脾脏
用 70% 乙醇对皮肤进行消毒。
沿着中线切开腹腔。
找到脾脏，并轻轻拉出。
3. 制备单细胞悬液
将脾脏放入无菌培养皿中。
用注射器和针头从脾脏中抽取细胞。
将细胞悬液转移到装有无菌 PBS 的 50 mL 离心管中。
用 PBS 重复洗涤两次。
4. 红细胞裂解
加入 12 mL 红细胞裂解液（例如 BD Pharm Lyse?）。
在室温下孵育 5 分钟。
用 PBS 洗涤两次。
5. 细胞计数
用细胞计数器计数细胞。
调整细胞浓度至所需的浓度（通常为每毫升 15 x 10^6 个细胞）。
6. 细胞分离（可选）
使用柱分离、荧光激活细胞分选 (FACS) 或其他方法分离所需的细胞亚群。
7. 培养
将分离后的细胞置于合适的培养基中。
在 37°C、5% CO2 的培养箱中培养。
提示保持所有材料和设备无菌至关重要。
使用新鲜的脾脏可获得最佳结果。
离心速度和时间应根据所使用的离心机而进行优化。
红细胞裂解液应根据制造商的说明进行使用。
可使用流式细胞术验证细胞分离的纯度。
4、小鼠脾细胞分离技术原理
小鼠脾细胞分离技术原理
脾脏是小鼠免疫系统的关键器官，其中含有丰富的淋巴细胞，包括 B 细胞、T 细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞。脾细胞分离技术旨在从脾脏中分离出这些淋巴细胞，以便进行进一步的实验分析。
常用分离方法
最常用的脾细胞分离方法有两种：
1. 密度梯度离心
将脾脏组织匀浆化并通过尼龙网过滤以去除碎屑。
在离心管中形成密度梯度（如 FicollPaque 或 Percoll）。
悬浮脾细胞溶液分层到梯度上。
通过离心，淋巴细胞将迁移到梯度中的特定密度层（通常在低密度层）。
收集淋巴细胞层，离心洗涤并重悬于培养基中。
2. 磁性细胞分选
使用抗原特异性抗体或通用抗原（如 CD45）包被磁珠。
将磁珠与脾细胞悬液孵育，使抗体与目标细胞表面的抗原结合。
将混合物放置在磁性分选柱中。磁珠与目标细胞结合，而未结合的细胞被洗脱。
收集磁性结合的细胞，离心洗涤并重悬于培养基中。
选择方法的考虑因素
选择脾细胞分离方法时，需要考虑以下因素：
实验目的：根据实验要求选择能分离出目标细胞群的方法。
细胞产量：密度梯度离心通常能获得较高的细胞产量，而磁性细胞分选则具有较高的选择性。
细胞存活率：密度梯度离心可能对细胞造成一定程度的应激，而磁性细胞分选则更为温和。
成本和方便性：磁性细胞分选通常需要价格昂贵的试剂和设备，而密度梯度离心则相对便宜且易于操作。
