干 🐞 细胞培养制备流程（干细胞培养与制 🐘 备详细步骤）

1、干细胞 🦁 培 🐝 养制备流程

干细 🍁 胞培养 🐋 制备流 💮 程

1. 组织或 🐶 细胞来源的获取

从骨髓、脂、肪、脐 💮 带血羊水或其他组织中 🐧 提取干细胞。

2. 组织 🦍 解 🐅 离 🐬

使用酶或机械方法将 🌿 组 🌷 织 🌾 解离成单个细胞悬液。

3. 细 🌿 胞 🌺 分离 🌾

使用细胞标记、免疫亲和 🌵 层析或流式细胞术对干细胞进行分离。

4. 培养基制备 🕊

配制 🐯 含生长因子、营养 🐎 物质和抗生素的 🐈 培养基。

5. 细胞 🐴 培 🐈 养

将分离后的干细胞接种到培养皿或培养瓶中，并置于受控 🌼 的培养箱中。

细 🐯 胞培养 🕷 箱提供适宜的温度、湿 🌷 度和二氧化碳浓度。

6. 培养基 🐬 更换

定期更 🌿 换培养基以清除废物和 🍁 补充营养。

7. 传 🍁 代 🕊

当细胞达到一定密度时 🦢 ，将它们转移到新 🐠 的培养皿或培养瓶 🦊 中。

传代有助于保持细胞 🐬 的活力 🐝 和增殖能力。

8. 分 🕸 化

根据需要，可以通过添加特 🐳 定的生长因子或培养条件诱导干细胞分化成特定的细胞类型。

9. 质 🐅 量控 🌾 制

定期进行质 🌴 量控制测试 ☘ ，包括细胞活力、形、态分化标志物表达和遗传稳定性。

10. 储 🐬 存 ☘ 和 🍀 运输

将制备好 🌿 的干细胞冷冻或玻璃化 🦆 保 💐 存，以供将来使用。

按照适当的 🐶 规程运输 🌺 干细胞至使用地点。

注 🐡 意 🐯 事项：

干细胞 🦍 培养需要 🌺 无菌和受控的环境。

培养条 🦋 件（如培养基 🐳 成分、温度和传代频率）因干细胞类型而异。

应在专业 🕊 人员的指导下进行干细胞培养。

遵守所有适当的伦理和监管 💐 指南。

2、干细胞 🪴 培养与制备详 🌿 细步骤

干细胞培 🐝 养和制 💮 备详细步骤 💮

培养 🌲 基（特定于细胞 🐞 类型）

血清 🐯 （如果需要）

胰酶（如 🐺 果需要传代）

细胞计数器 🐶

细胞 🌲 刮 🐬 刀 🐛

生物安全 🦅 柜

1. 细胞复苏和 🐛 传代

将冻存的干细 🐼 胞从液氮中 🐡 取出。

将细胞 🌾 快速解冻，加入预热的培养基中。

将 🐈 细胞转移到培养瓶 🦁 中，并加入培养基至所 🐞 需体积。

在37°C、5% CO2环境下培养 🐳 。

2. 细胞培 🦋 养 🦅

定期更换培养基（每23天一 🐺 次）。

当细 🍀 胞达到8090%汇合时，需要传代。

3. 细 🦍 胞 🦆 传 🐘 代

吸 🐯 出 🦢 培养基。

加入胰酶（浓度和 🕷 时间取决于细胞类型）。

将细胞孵育至 🌾 脱 🌿 离培 🌸 养皿。

加入培养基终止胰 🕸 酶活性，并用移液枪轻 🐎 轻吹 🪴 打细胞以分散。

计数 🦄 细胞并根据需要调整密度。

将细胞转移到新培养皿或培养瓶中，并加入新 🍁 鲜培养基。

4. 分化或诱导 🐟 为特定 🐠 细胞类型

根据需要 🌲 ，可以将干细胞诱导为特定的 🦟 细胞类型。

添加特定 🦅 的 🌹 生长因子或化学试剂以引导分化。

监测细胞 🕷 形态和标记物表达以确认分化。

5. 细胞 🦟 收 🌼 获 🕸

当 🐬 细胞 🐯 达到所需的密度或生长 💮 阶段时，即可收获。

吸 🦄 出培养基。

加入胰酶（浓度 🦆 和时间取决于细胞类型）。

将细胞孵 🐘 育至脱离培养皿。

加入培养基终 🐛 止胰酶活 🐡 性，并用移液枪轻轻吹打细胞以分散。

计数细胞并根据 🕊 需要 🐬 制备用于后续实验或应用。

所有步骤均在生物安全柜中操作 🦊 以保 🕊 持无菌。

使用高质 🌾 量的试剂和材 🌷 料 🐼 。

定期监 🐱 测细 🦊 胞健康 🐱 状况。

优化培养条件以获得最佳生长 🦄 和分化。

遵守机构的安 ☘ 全协议和指导方 🌲 针。

3、间充质 🐯 干细胞的培养流程 🌷

间充质干细胞培 🌷 养 🌾 流程

1. 样品 🦢 采 🦊 集

骨髓：从骨盆 🦋 后脊柱穿刺抽取。

脂肪：从腹部 🐦 或大腿脂肪组织中抽取。

2. 组织 🌷 消 🦟 化 🐟

使用胶 🐒 原酶或胰蛋白酶消化 🐛 组织，释放间充质干细胞。

3. 细胞 🐼 悬浮

将组织 🦆 消化液离心，收集细胞。

用培养基重悬 🌷 细胞 🐛 ，形成细胞悬浮液。

4. 单 🌸 核细胞 🦁 扩增

将 🐴 细胞悬浮液接种到含 🌴 单核细胞生长因子的培养基中。

细胞将在几 🕷 周内 🌴 增 🕸 殖并分化。

5. 单克 🐱 隆培养（可 🐶 选 🕊 ）

单克隆培養技術可以分離出具有特定表型和功能的單 🦉 一細胞株。

使用流式细胞术或磁珠分选法对细胞进行标记和 🐟 分选。

6. 培养 💐 基 🪴 更 🌵 换

定期更换 🌺 培养基以清除 🐺 代谢废物 🦁 并补充营养。

培养基的成分会随着细胞的不同阶段而变化 🐳 。

7. 传 🌺 代 🐛

当细胞达到一定的密度时，需，要 🌷 进行传代以保持细胞活力和增殖能力。

使用胰 🦅 蛋白酶或 🍀 EDTA消化细胞，然后重新接种到 🐒 新鲜的培养基中。

8. 分 🐋 化 🐼

间充质干细胞具有多能性，可 ☘ ，以分化成多种类型的细 🐅 胞包括：

骨 🐎 细 🐦 胞 🐝

软骨 🌳 细胞 🌾

脂肪 🐴 细胞 🐧

肌 🦊 细 🦋 胞

培 🐶 养条件 🌵 ：

培养基：含αMEM、DMEM或其他 🐠 优 🐧 化培养基 🍀 。

生长因子：单核细胞生长因子、成、纤维细 🌾 胞生长因子血小板衍生 🍁 生长因子等。

培 🌸 养温度：37°C

CO2浓 🌷 度 🐞 ：5%

培养时间 🦉 ：数周至数月，具体取决于培 🐒 养条件和目的。

注 🐵 意 🐅 事 🦊 项：

保持无菌操作 🦁 以防止污 🐘 染。

定期 🐵 监测 🦊 细胞形态和增殖率 🐕 。

根据细 🦢 胞的 💐 生长状态和培养目的调整培养条件。

4、干细胞外泌 🌺 体制备流程

干细胞外泌体制备 🌻

干细胞培 🐠 养液

超速 🦁 离心机 🐟

无菌试 🦋 管 🦅 和 🌷 培养皿

过 🦢 滤 🐟 装 🐠 置（0.22 μm）

蛋 🦁 白 🕷 质 🐕 定量试剂盒

外泌体分离试剂 🐛 盒或超速离 🌴 心法

1. 收集干细 🦁 胞 🐒 培养液 🐠

收集生长到对数生长期的干细胞培养 🪴 液。

去除死亡细胞 🐬 和 🌷 细胞碎片。

2. 超速离心去除细胞碎片和蛋 🌳 白质

将培养液以 🐋 300 x g 离心 10 分钟，去除细胞碎 🐳 片。

将 🐦 上清液转移到新的试管中，并以 10,000 x g 离心 20 分，钟去除蛋白质。

3. 使 🐞 用外泌体分离 🐱 试 🦉 剂盒

根 🐶 据制造商的说明 🐵 ，使用外泌体分离试剂盒纯化外泌体。

该试剂盒通常包括一个聚合沉淀 ☘ 步骤。

4. 超速 🕸 离 🐡 心法 🐕

将上清 🐶 液以 100,000 x g 离心 🌹 70 分钟，收集沉淀物 🐯 。

沉淀物 🐶 即为外泌 🕷 体。

5. 洗涤 🍁 和过 🌻 滤 🌸 （可选）

将外泌体沉淀物用 PBS 重新悬浮并超速离 🐝 心，以去除 🦈 残留的蛋白质和杂质。

使用 0.22 μm 过 🐳 滤装置过滤外泌体 🦆 悬浮液，以去除任何剩余的杂质。

6. 蛋白质 🐘 定量

使用蛋白质定量试剂盒测量外泌体悬浮液的 🐬 蛋白质浓度。

7. 保 🌳 存 🐠

外 🦋 泌体可 🕸 储存于 80°C 中，保质期长达数 🐞 月。

使 🌻 用新鲜的细胞培养液可获得最 🦢 佳结果 🌴 。

避免过 🌺 度超速离心，以免破坏外泌体。

使 🌷 用无菌设备和试剂，以防止污染。

外泌 🐵 体的质量和产量会因干细胞类型和培养条 🌻 件而异。