大鼠毛囊干细胞分离培养（大鼠毛囊干细胞分离培养方法）
- 作者: 陈瑞瑾
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、大鼠毛囊干细胞分离培养
大鼠毛囊干细胞分离培养
材料毛囊（100200 根）
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
胎牛血清 (FBS)
抗生素/抗真菌剂（青霉素链霉素两性霉素）
Collagenase IV
Dispase II
Trypsin 0.25%
培养皿（60 mm）
移液器显微镜
方法
1. 毛囊提取
将大鼠处死，剃除背部毛发。
用镊子从皮肤中拔出毛囊。
尽可能多地收集 100200 根毛囊。
2. 毛囊消化
将毛囊转移到装有 DMEM + 10% FBS + 抗生素/抗真菌剂的 60 mm 培养皿中。
在 37°C、5% CO2 下消化 2 小时。
3. 组织破碎
向培养皿中加入 1 mL Collagenase IV（2 mg/mL）和 1 mL Dispase II（4 mg/mL）。
在 37°C、5% CO2 下处理 1 小时。
使用移液器尖端将组织轻轻破碎。
4. 细胞分离
将细胞悬液转移到装有 5 mL DMEM + 10% FBS + 抗生素/抗真菌剂的新培养皿中。
离心 5 分钟，1000 rpm。
丢弃上清液。
5. 酶消化
向细胞团加入 1 mL Trypsin 0.25%。
在 37°C、5% CO2 下消化 5 分钟。
用 4 mL DMEM + 10% FBS + 抗生素/抗真菌剂终止消化。
离心 5 分钟，1000 rpm。
丢弃上清液。
6. 细胞培养
将细胞重悬于 DMEM + 10% FBS + 抗生素/抗真菌剂中。
将细胞转移到新的培养皿中。
在 37°C、5% CO2 下培养。
验证使用流式细胞术对干细胞标志物（例如 CD34、CD45、CD90）进行免疫表型分析。
进行克隆形成单元 (CFU) 分析以确定干细胞的多能性。
2、大鼠毛囊干细胞分离培养方法
大鼠毛囊干细胞分离培养方法
材料和试剂
大鼠皮肤
无菌剪刀和镊子
无菌培养基（DMEM/F12）
胰蛋白酶EDTA
胶原酶 IV
1% 青链霉素链霉金霉素
胎牛血清（FBS）
离心管细胞培养板
培养箱程序
1. 皮肤收集：
剃除大鼠背部的毛发。
用 70% 乙醇消毒皮肤表层。
用无菌剪刀和镊子切除 1 cm x 1 cm 大小的皮肤块。
2. 毛囊分离：
将皮肤块浸泡在含胰蛋白酶EDTA 和胶原酶 IV 的无菌培养基中，在 37°C 下孵育 12 小时。
用无菌镊子小心分开毛囊。
3. 离心沉淀：
将分离出的毛囊加入离心管中。
以 1000 rpm 离心 5 分钟。
弃去上清液，保留沉淀。
4. 细胞培养：
将沉淀重悬于新鲜的无菌培养基中。
加入 1% 青链霉素链霉金霉素和 10% FBS。
将细胞悬液接种到无菌培养板中。
培养细胞于 37°C，5% CO2 的潮湿环境中。
细胞鉴定免疫表型分析：使用流式细胞术检测 CD34、CD44 或其他毛囊干细胞标记物。
多向分化潜能：在不同的培养条件下诱导细胞分化为角质细胞、黑色素细胞或脂肪细胞。
提示使用新鲜的皮肤样品以获得最佳结果。
小心处理毛囊，避免损伤细胞。
培养基应定期更换（每 23 天）以确保细胞健康。
根据需要分传细胞以保持细胞活力。
3、大鼠皮肤成纤维细胞分离培养
大鼠皮肤成纤维细胞的分离和培养
材料：大鼠皮肤样品
无菌手术器械
培养液（例如 Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM]）
抗生素（例如青霉素、链霉素）
血清（例如胎牛血清 [FBS]）
胰蛋白酶EDTA 溶液
培养皿和培养瓶
Co2 培养箱
步骤：1. 皮肤样品采集
在无菌条件下，用手术剪从大鼠背部剪取皮肤样品（约 1 cm2）。
用无菌棉签或镊子小心地去除脂肪和表皮组织。
2. 消毒和切块
用 70% 乙醇消毒皮肤样品。
用无菌手术刀将皮肤样品切成小块（约 1 mm3）。
3. 酶解
将皮肤块转移到含有胰蛋白酶EDTA 溶液的离心管中。
在 37°C 孵育 3060 分钟，期间轻柔振荡。
4. 中和和离心
加入同样体积的培养液，含有 10% FBS，以中和酶活性。
4°C 离心 5 分钟，1000 x g。
5. 培养
小心弃去上清液。
用新鲜的培养液重悬细胞沉淀，使其达到所需的细胞浓度（例如 5 x 10? 个细胞/毫升）。
将细胞接种到培养皿或培养瓶中。
在 37°C、5% Co2 的培养箱中培养细胞。
每 23 天更换培养液。
培养条件：
温度：37°C
大气：5% Co2
培养液：DMEM，含 10% FBS 和抗生素
更换培养液频率：每 23 天
提示：使用无菌技术，以防止细胞污染。
轻轻处理细胞，以避免损伤。
定期监测细胞生长和形态，以确保细胞健康。
根据需要分株细胞，以保持细胞活性。
4、大鼠毛囊干细胞分离培养原理
大鼠毛囊干细胞分离培养原理
1. 组织采集：
从健康大鼠中剔除背侧或腹部毛囊，用无菌生理盐水清洗并剪碎。
2. 酶消化：
将剪碎的毛囊组织悬浮在含有胶原酶和透明质酸酶的酶溶液中。酶消化时间和浓度取决于毛囊类型和研究目的。
3. 细胞分离：
酶消化后，将细胞悬液通过过滤网或离心获取单细胞悬液。
4. 免疫磁珠分选：
对于表达特定表面标志物的干细胞，可以使用免疫磁珠进行分选。将免疫磁珠与细胞悬液孵育，磁珠会与目标细胞上的抗原结合，从而通过磁力分选收集目标细胞。
5. 培养：
收集的干细胞悬液接种到无血清或低血清培养基中，培养基中含有特定生长因子和营养物质，以促进干细胞生长和增殖。
6. 扩增和传代：
当细胞达到一定的融合度时，将进行传代，即重新接种到新鲜培养基中。通过多次传代，可以扩增干细胞数量。
7. 验证：
使用流式细胞术、免疫荧光或分化诱导等方法验证分离的细胞 是否具有毛囊干细胞的特征，如表面标志物表达、分化潜能和再生能力。
