胚胎干细胞打靶技术（基于胚胎干细胞的基因打靶技术目前能在老鼠中应用）
- 作者: 王洛屿
- 来源: 投稿
- 2025-01-19
1、胚胎干细胞打靶技术
胚胎干细胞打靶技术
定义胚胎干细胞打靶技术是一种用于改造胚胎干细胞基因组的技术，使研究人员能够创建和研究基因敲除小鼠，以了解特定基因在发育和疾病中的作用。
过程该技术涉及以下步骤：
1. 靶向向量设计：设计一个 DNA 载体，包含一个选择标记（例如抗生素抗性）和同源臂。同源臂是与目标基因相匹配的 DNA 片段。
2. 电穿孔：使用电穿孔技术将靶向向量导入胚胎干细胞。
3. 同源重组：靶向向量通过同源重组整合到目标基因的内含子中。同源重组是 DNA 修复的一种形式，其中根据模板链修复受损的 DNA。
4. 敲除过程：选择标记用于筛选已敲除目标基因的胚胎干细胞。没有整合靶向向量的细胞不会存活。
5. 嵌合体生成：已敲除的胚胎干细胞被注射到胚胎囊泡中，以产生嵌合体小鼠。嵌合体动物包含来自原始胚胎和已敲除的胚胎干细胞的细胞。
6. 近交：嵌合体小鼠相互交配，产生后代，其中一些是纯合子敲除小鼠（仅从敲除的胚胎干细胞中继承基因）。
应用胚胎干细胞打靶技术是研究基因功能和疾病机制的强大工具。它已被用于：
创建基因敲除小鼠，以研究特定基因在发育和疾病中的作用
研究复杂疾病的遗传基础
开发新的药物和治疗方法
改进疾病建模和药物筛选
优点胚胎干细胞打靶技术的优点包括：
靶向特定基因的高特异性
创建具有纯合子敲除的遗传纯合动物模型
允许对基因功能进行详细的表型分析
局限性胚胎干细胞打靶技术的局限性包括：
该过程耗时且昂贵
创建纯合子敲除小鼠可能会导致胚胎致死
并非所有基因都容易靶向，特别是那些具有高度重复性区域的基因
2、基于胚胎干细胞的基因打靶技术目前能在老鼠中应用?
是的，基于胚胎干细胞的基因打靶技术目前可以在老鼠中应用。
这种技术涉及使用 CRISPRCas9 或 TALENs 等基因编辑工具来靶向和修改胚胎干细胞中的特定基因。一旦基因被修改，这些胚胎干细胞就可以注射到胚胎中，导致具有所期望基因改变的后代小鼠。
这种技术已被广泛用于老鼠模型的研究中，用于研究基因功能、疾病建模和治疗开发。
3、胚胎干细胞基因打靶后筛选使用
胚胎干细胞基因打靶后筛选使用
胚胎干细胞 (ESC) 是多能干细胞，具有分化为各种细胞类型的潜力。基因打靶是一种技术，可用于在 ESC 中引入或修改特定基因。基因打靶后，需要筛选出经过修饰的 ESC 克隆。
筛选方法：
抗生素选择：在基因打靶中使用带有抗生素选择标记的质粒。经过修饰的 ESC 将对该抗生素具有抗性，而未修饰的 ESC 则不具有抗性。
荧光标记：引入带有荧光标记的基因。经过修饰的 ESC 将表达荧光蛋白，可以用荧光显微镜进行筛选。
PCR 分析：使用 PCR 分析来检测靶向基因中的修饰。
Southern 印迹：一种分子杂交技术，用于检测基因组 DNA 中特定的 DNA 序列。
选择经过修饰的 ESC 克隆：
筛选过程可以识别出大量经过修饰的 ESC 克隆。需要进一步选择具有所需基因型和无脱靶效应的克隆。
应用：经过基因打靶的 ESC 克隆可用于：
疾病建模：研究特定基因缺陷如何导致疾病。
再生医学：生成用于治疗疾病的细胞和组织。
药物筛选：测试潜在药物对特定基因或通路的影响。
转基因动物：通过将经过修饰的 ESC 注射到胚胎中来生成转基因动物。
关键考虑因素：
脱靶效应：基因打靶过程可能会导致靶向基因之外的基因发生意外修饰。
基因表达水平：经过修饰的 ESC 克隆的基因表达水平可能会因插入位点而异。
染色体畸变：基因打靶过程可能会导致染色体畸变。因此，需要对经过修饰的 ESC 克隆进行染色体核型分析。
4、胚胎干细胞打靶技术有哪些
胚胎干细胞打靶技术
胚胎干细胞打靶技术是一组强大的工具，用于在胚胎干细胞中靶向特定基因进行修改。这些技术使研究人员能够研究基因功能、开发疾病模型并为再生医学应用生成定制细胞。
主要胚胎干细胞打靶技术包括：
1. 同源重组（HR）
利用天然DNA修复机制将外源性DNA片段插入目标基因座。
使用电穿孔或转座酶将DNA导入胚胎干细胞。
筛选带有正确插入的细胞。
2. 非同源末端连接（NHEJ）
利用非同源末端连接途径来插入外源性DNA片段，该途径通常用于产生敲除或插入突变。
使用锌指核酸酶、TALEN 或 CRISPRCas9 系统在目标基因座产生双链断裂。
引入包含外源性DNA片段的修复模板。
3. CRISPRCas9 编辑
利用 CRISPRCas9 系统来切割特定基因座。
引入包含针对基因断裂的修复模板，可以进行插入、缺失或替换突变。
相比于传统的打靶技术，具有更高的效率和目标特异性。
4. 转座酶转座
利用转座酶来插入外源性DNA片段到特定的基因座。
使用转座酶可转座元件系统，其中转座酶酶促作用介导可转座元件的整合。
可实现高效、无标记的基因编辑。
5. TALEN 编辑
利用 TALEN（转录激活子样效应核酸酶）系统来切割特定基因座。
通过连接可变 DNA 结合域 (RVD) 定制 TALEN，以识别目标基因序列。
引入包含针对基因断裂的修复模板。
6. 锌指核酸酶（ZFN）编辑
利用锌指核酸酶 (ZFN) 系统来切割特定基因座。
通过连接可变锌指域 (ZFD) 定制 ZFN，以识别目标基因序列。
引入包含针对基因断裂的修复模板。
