果蝇肾脏干细胞分离（果蝇肾脏干细胞分离的原因）
- 作者: 刘若安
- 来源: 投稿
- 2024-12-11
1、果蝇肾脏干细胞分离
果蝇肾脏干细胞分离
果蝇 (Drosophila melanogaster) 是一种重要的模式生物，用于研究人类疾病和生物学的基本过程。果蝇肾脏干细胞是位于马氏管中的多能细胞，负责肾脏的再生和修复。分离这些干细胞對於研究腎臟發育、疾病機制和再生策略至關重要。
分离方法：
1. 果蝇培养和收集：将果蝇在合适的培养基中培养并收集需要的发育阶段（例如，幼虫或成虫）。
2. 解剖和组织分离：将果蝇解剖并小心地分离出肾脏组织。
3. 酶解：使用蛋白酶或胶原酶等酶将肾脏组织解离为单个细胞。
4. 细胞表面标记：使用荧光抗体或磁珠标记特定于果蝇肾脏干细胞的细胞表面标记物，例如 Escargot (Esg)。
5. 细胞分选：使用细胞分选器（例如，流式细胞仪或磁性细胞分选）分离出标记的细胞。
鉴定和验证：
1. 细胞形态学：分离出的细胞应呈现出肾脏干细胞的特征性形态，例如圆形或椭圆形、大核仁和大胞质体积。
2. 免疫荧光染色：使用 Esg 或其他肾脏干细胞特异性标记对分离出的细胞进行免疫荧光染色。
3. 细胞培养：分离出的细胞应能够在体外培养并形成腎臟細胞球體。
4. 移植实验：将分离出的细胞移植到受损的果蝇肾脏中，观察它们是否能够整合并促进肾脏再生。
应用：分离出的果蝇肾脏干细胞用于多种应用，包括：
研究肾脏发育和再生机制
探索肾脏疾病（例如，慢性肾病）的病理生理学
开发新的肾脏再生疗法
筛选肾脏毒性药物和化学物质
局限性：虽然果蝇肾脏干细胞是研究人类肾脏干细胞的有用模型，但它们与人类同源物之间可能存在一些差异。
分离果蝇肾脏干细胞可能具有挑战性，并且最终的产量可能较低。
2、果蝇肾脏干细胞分离的原因
果蝇肾脏干细胞被分离的原因包括：
理解肾脏发育和功能：果蝇肾脏干细胞是研究肾脏发育和功能机制的理想模型。它们允许研究人员探索细胞分化、再生和组织维持的底层过程。
研究肾脏疾病：果蝇与人类共享许多疾病相关的基因，包括肾脏疾病。分离果蝇肾脏干细胞可以帮助研究人员模拟人类肾脏疾病，并测试潜在的治疗策略。
发育再生疗法：肾脏干细胞具有自我更新和分化的能力，这使它们成为再生医学中潜在的有用工具。分离果蝇肾脏干细胞有助于了解它们的再生潜力，并开发基于细胞的治疗方法来治疗肾脏损伤。
比较生物学：比较果蝇和人类的肾脏干细胞可以揭示肾脏发育和功能的进化保守性。这可以帮助确定跨物种的通用机制，并为进化生物学提供见解。
建立遗传筛选系统：果蝇是一个强大的遗传模式生物，允许进行大规模的遗传筛选。分离果蝇肾脏干细胞可以帮助建立筛选系统，以鉴定调节肾脏发育和功能的基因。
3、果蝇肾脏干细胞分离方法
果蝇肾脏干细胞分离方法
材料：雄性果蝇（w;; eyFlp;; UASmCD8::GFP/CyO; tubGal80ts）
成虫培养基
二氧化碳安乐箱
解剖镜无菌解剖剪刀
无菌解剖镊子
1x PBS
70% 乙醇
4% 多聚甲醛
DEPC 灭菌水
步骤：1. 果蝇培养
将雄性果蝇转移到成虫培养基中。
将果蝇置于 25°C 培养 23 天。
采用二氧化碳安乐箱对果蝇进行麻醉。
2. 解剖
用解剖剪刀剪开果蝇胸部，露出内脏。
用解剖镊子小心移除消化道。
进一步小心移除气管和脂肪组织。
3. 肾脏分离
用解剖镊子抓住肾脏，并将其小心地与周围组织分离。
将肾脏放入盛有 1x PBS 的培养皿中。
4. 多聚甲醛固定
将肾脏转移到盛有 4% 多聚甲醛的培养皿中。
在室温下固定 1 小时。
5. 乙醇脱水
将肾脏转移到装有 50% 乙醇的培养皿中。
在室温下孵育 15 分钟。
重复此步骤，依次使用 70% 和 95% 的乙醇。
6. 组织离解
将肾脏转移到装有 100 μl 离解缓冲液的 PCR 管中。
将 PCR 管置于 37°C 的水浴中 20 分钟。
彻底振荡 PCR 管，以离散细胞。
将细胞悬液转移到 1x PBS 中。
7. 流式细胞术分选
使用流式细胞仪对细胞悬液进行分选。
使用 GFP 作为干细胞标记。
收集 GFP 阳性细胞。
8. 细胞培养
将收集到的 GFP 阳性细胞培养在适合果蝇干细胞的培养基中。
将细胞置于 25°C 培养。
注意事项：
所有步骤均应在无菌条件下进行。
使用锋利且无菌的解剖工具。
仔细分离肾脏，以避免组织损伤。
优化流式细胞术分选参数以获得纯净的干细胞群。
4、果蝇肾脏干细胞分离过程
果蝇肾脏干细胞分离过程
材料：成年果蝇（35 天龄）
dissecting plates
PBS（磷酸盐缓冲液）
0.5% 胰蛋白酶/EDTA
滤器（40 微米）
离心机细胞培养基：果蝇 schneiders 培养基，补充 10% 胎牛血清和 1% 青霉素链霉素
培养皿显微镜
步骤：
1. 解剖果蝇：
用乙醚麻醉果蝇。
将果蝇背朝下固定在解剖板上，使其腹部暴露在外。
使用锋利的镊子，小心地切除果蝇的头部和翅膀。
2. 分离肾脏：
将腹部分成两半，露出内脏。
定位位于身体两侧的肾脏，它们呈白色或淡黄色。
使用镊子小心地摘除肾脏。
3. 酶解：
将肾脏转移到装有 0.5% 胰蛋白酶/EDTA 的培养皿中。
在 37°C 下孵育 30 分钟，偶尔摇动。
4. 过滤：
将酶解后的悬浮液通过 40 微米滤器过滤，以去除细胞碎片。
5. 离心：
将滤液转移至离心管并以 200 x g 离心 5 分钟。
去除上清液。
6. 重悬和培养：
用果蝇 schneiders 培养基重悬细胞沉淀。
将细胞转移到培养皿中，置于 25°C 恒温箱中培养。
鉴定：分离出的干细胞可以通过以下标志物进行鉴定：
ESCARGOT（ESA）： 果蝇中干细胞的标志性转录因子。
缺乏 Delta： 一种 Notch 配体，在分化细胞中表达。
细胞形态： 圆形、小的细胞核和大量胞浆。
