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小鼠造血干细胞流式(小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备与观察)

  • 作者: 刘北言
  • 来源: 投稿
  • 2024-12-24


1、小鼠造血干细胞流式

小鼠造血干细胞流式细胞术分析

简介

流式细胞术是一种强大的技术,用于分析和分离造血干细胞 (HSC)。HSC 是多能干细胞,可在整个生命中产生所有类型的血细胞。流式细胞术可用于鉴定 HSC 群体、研究其分化潜力并评估其对治疗的反应。

样品制备

骨髓或脾脏样品

红细胞裂解

复悬于流式缓冲液中

标记抗体

HSC 特异性标记:

Sca1

cKit

CD34

CD150

CD48

分化标记:

CD3 (T 细胞)

CD4 (记忆 T 细胞)

CD8 (细胞毒性 T 细胞)

B220 (B 细胞)

F4/80 (巨噬细胞)

流式细胞术采集

流式细胞术仪

抗体标记样品

收集前向散射 (FSC)、侧向散射 (SSC) 和荧光数据

数据分析

门控:使用 FSC 和 SSC 确定细胞群。

识别 HSC 群体:使用 Sca1、cKit 和其他 HSC 特异性标记。

分析分化:使用分化标记评估 HSC 群体在不同细胞系中分化的潜力。

定量分析:计算每个细胞群的百分比和绝对数量。

应用

HSC 表型分析:确定 HSC 群体的表面标记表达。

分化潜能评估:研究 HSC 在不同细胞系中分化的能力。

治疗反应监测:评估造血干细胞移植或其他治疗方法对 HSC 群体的影响。

干细胞生物学研究:深入了解 HSC 的发育、功能和监管。

注意事项

使用高品质抗体和试剂。

优化实验参数,包括抗体浓度和补偿设置。

使用适当的阳性对照和阴性对照。

熟练进行数据分析和解释。

2、小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备与观察

材料和试剂

小鼠骨髓

细胞培养基

细胞收获液

高渗缓冲液

碳酸钾枸橼酸盐缓冲液(KCC)

甲醇乙酸溶液

染色液(Giemsa 显带法或 Q 显带法)

显微镜
步骤:

1. 骨髓细胞制备

从小鼠股骨或胫骨中抽取骨髓。

将骨髓细胞悬浮在细胞培养基中。

通过层流细胞计数仪计数细胞。

2. 细胞收获

将细胞悬液离心以收集细胞沉淀。

用细胞收获液重悬细胞沉淀,轻轻吹打。

3. 高渗处理

将细胞悬液转移到高渗缓冲液中,孵育 20 分钟,以使染色体膨胀。

4. 低渗处理

将细胞悬液转移到 KCC 缓冲液中,孵育 8 分钟,以使染色体收缩。

5. 固定

将细胞悬液固定在甲醇乙酸溶液中,至少 30 分钟。

6. 显带处理

根据所选显带方法进行处理。

Giemsa 显带法:在染色液中孵育 510 分钟。

Q 显带法:在荧光染色液中孵育 10 分钟,然后在 UV 灯下观察。

7. 玻片制备

将细胞悬液滴在干净的载玻片上。

将载玻片倾斜放置,待悬液干燥。

8. 观察

将载玻片置于显微镜下,使用油浸物镜观察染色体。

拍摄代表性染色体图像。

注意:

整个过程必须在无菌的条件下进行。

显带处理时间可以根据染色体凝缩程度而调整。

G 显带法染色出 G 带(富含 AT 的区域),而 Q 显带法染色出 Q 带(富含 GC 的区域)。

3、小鼠骨髓造血干细胞形成各种血细胞

小鼠骨髓造血干细胞 (HSC) 具有自我更新和分化为多种血细胞谱系的潜能,包括:

红细胞谱系:红细胞

粒细胞谱系:中性粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞

单核细胞谱系:单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞

淋巴细胞谱系:T 细胞、B 细胞、自然杀伤 (NK) 细胞

血小板谱系:血小板

4、小鼠和人的造血干细胞都具有的表

小鼠和人的造血干细胞共同表达的表:

CD45:白细胞共同抗原

CD34:造血干细胞和祖细胞标记

CD133:造血干细胞和祖细胞标记

CD90:间充质干细胞和造血干细胞标记

CD105:间充质干细胞和造血干细胞标记

CD117:cKit 受体,在造血干细胞和祖细胞中表达

CXCR4:趋化因子受体,在造血干细胞和祖细胞中表达,参与骨髓归巢

Sca1:小鼠造血干细胞特异性抗原,在人造血干细胞中不表达

Lineage:一系列标记,用于排除成熟血细胞(例如 CD3、CD14、CD16、CD19、CD20)

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