悬浮干细胞免疫荧光 🐞 （悬浮细胞免疫荧光confocal皿）
- 作者: 李珺颜
- 来源: 投稿
- 2025-02-24
1、悬浮干 🐦 细胞免疫荧光
悬 🐦 浮干细 🌼 胞免疫荧 🐧 光
原理悬浮干细胞免疫荧光是一种使用荧光标 🐦 记的抗体对悬浮干细胞中的 🦊 特定蛋白进行可视化的技术。通过流式细胞术检测荧光信号可，以定。量分析特定蛋白在干细胞群中的表达水平和分布
步骤1. 细胞制 🕷 备：将悬浮干细胞收获 🐘 并洗涤 🪴 。
2. 固定 🦅 ：使用甲醛或戊二醛 🐼 等固定剂固定 🐶 细胞。
3. 通透：使用Triton X100或皂苷等通 🕊 透剂 🐠 使细 🐧 胞膜通透。
4. 抗体孵育：加入标记有荧光染料（例如 FITC、PE、APC）的特异性抗体孵育，以识别 🐱 待检测的蛋白。
5. 洗涤洗：去多 🌹 余的抗 🕷 体。
6. 流式细胞术分析：使 🦈 用流式细胞仪检测细胞中荧光信号的强度和分布。
应用悬 💮 浮干细胞免疫荧光广泛应用于：
干细胞表型分析 🦋 ：识别和表征悬浮干细胞亚群。
蛋白表达研究：定量分析特定 🕊 蛋白在干细胞中的表达水平。
细胞分选：根据荧光标记对特定表 🐯 达蛋白 🌵 的干细胞进行分选。
干细胞分化研究：追踪 🐘 和分析干细胞分化的过 🐟 程。
优点可以对大 🌼 量细胞 🐝 快速进行分析。
灵敏度高，可 💮 以 🦅 检测 🦍 低表达的蛋白。
多色免疫荧光可 🐺 以同时检测多个蛋 🌵 白。
缺点样本 🌲 制 🦊 备 🐼 需要专业技术。
抗体质量对结果的准 🐠 确性至关 🐴 重要 🐅 。
荧光标记可能会影响 🕸 细胞活性。
2、悬浮细胞免疫荧 🐴 光confocal皿
什么是悬浮细胞免疫荧光共聚焦皿 🌻 ？
悬浮细胞 🐟 免疫荧光共聚焦皿是一种特殊的培养皿，专为免疫荧光染色悬浮细胞而设计。
组 🐘 成和 🐴 特 🌻 点：
由高纯度的 🌳 硼硅酸盐玻璃制成，具有出色的光学清晰度。
具有凹槽 🦢 或孔隙结构，可容纳悬浮细胞。
表 ☘ 面经过聚赖氨 🐦 酸或其 🐴 他涂层处理，以促进细胞附着。
具有半 🦈 透膜底 🍀 部或网格 🕊 ，允许显色剂和洗涤液的流动。
可耐受 🌳 化学物质 🐘 、酶 🌾 和紫外线。
用途：悬浮细胞免疫荧光共聚焦皿用于在悬浮细胞上进行免疫荧光染 🌻 色，以研究细胞内蛋白的时空分布。
优势：细胞贴附：涂层处 🌻 理促进细胞附着，防止细胞在 🌳 染色过程 🌾 中脱落。
半透膜或网格：允许显色剂和洗涤液自由流动，确保 🦢 高效的免疫荧光染色。
光 🌹 学清晰度：高纯度的 🦍 硼硅酸盐玻璃提供优异的光学清晰度，有利于共聚焦成像。
耐用性：能够耐 🪴 受化学物质、酶 🐳 和紫外 🕸 线，便于多次使用。
应用：流 🐴 式细胞 🌳 术样 🦢 品制备
免疫荧 💮 光染色 🍁 和共聚焦成 🐎 像
活 🐳 细胞动 🌻 态成 🌿 像
药物筛选和 ☘ 开发
3、细 🐈 胞悬 🐘 液免疫荧光染色步骤
细胞悬液免疫荧光染色步 🌻 骤 🐛 ：
材料：细胞 🐧 悬液 🐧
抗 🦆 体（一 🌿 抗 🐛 ）
荧光标记 🦊 的二抗 🐕 二抗（）
洗涤缓 🐝 冲液（如 PBS 或 🐎 缓冲液 FACS ）
固 🦢 定剂 🐧 （如 4% 甲醛或甲 100% 醇）
透化剂（如 0.1% Triton X100 或 🐧 0.1% NP40）
封闭剂（如 🦊 1% BSA 或 5% 羊血清）
染 🐺 料 🐵 （如 🐧 DAPI）
步骤：1. 固 🦄 定 🐴 ：
将细胞悬液以 100,000500,000 个细胞/ml 的浓度悬浮在固定剂中 🐱 。
室 🐋 温孵育 15 分钟 🦋 或 4°C 下孵育过夜。
离 🌺 心收集细胞并用洗 🐬 涤缓 🐵 冲液洗涤。
2. 透 🐎 化 🐕 ：
将细胞悬浮在透化剂中（浓度和孵 🌷 育时间根据靶蛋白而定）。
室 🌿 温 🌿 孵育 🕸 510 分钟。
用洗涤缓 🕊 冲液洗 🍀 涤。
3. 封 🐛 闭 🦅 ：
将细胞悬浮 🍁 在封闭剂中室温孵育 1 小时。
离 🐵 心并用洗涤缓冲液洗涤。
4. 一 🐦 抗 🦉 孵育 🐟 ：
将细胞悬浮在稀释的一抗溶液 🐼 中抗。体。浓度和孵育时间应根据靶 🦉 标和抗体而优化
室温或 4°C 下孵育 💮 12 小时。
用洗 🦊 涤缓冲液洗涤。
5. 二 🐠 抗 🐎 孵育：
将细胞悬浮 🪴 在稀释的荧光标记二抗 🐞 溶液中。
室温孵育 🦄 4560 分 🌷 钟 🐞 。
用 🌷 洗 🦍 涤缓冲液洗涤 🌿 。
6. 染 🐧 色 🐕 ：
可选：将细胞悬 🌹 浮在染料（如 DAPI）溶 🦁 液中 🕷 室温孵育 510 分钟。
用洗涤缓 🐯 冲液洗涤 🐼 。
7. 分 🦍 析 🐱 ：
可 🐳 使用流式细胞仪 🦉 或共聚焦显微镜分析染色细胞。
4、干 🌹 细胞悬浮成 🐅 球实验
干 🦄 细胞悬浮成球实验
目的研究干 🍀 细胞悬浮培养中的聚集行 🌷 为。
生成具有自我更新 🌵 和分化潜能的干细胞 🐯 球体。
材料干细胞
培养基（含生长 🐘 因 🦁 子）
培养皿或悬浮 🦟 瓶
生物转轮或搅拌 🐕 器
显微镜移液枪
方法
1. 细胞 🐅 制 🐡 备 🦟
从培养物 🌼 中收集干细 🦉 胞。
计数并调整细 🌻 胞浓度 🦄 为细胞 15 x 10^5 /mL。
2. 悬 🦁 浮培养
将细 🌳 胞悬液接种到培养皿或悬浮瓶中。
将培养物 🌳 置于生物转轮或搅 🕊 拌器上，以提供持 🪴 续的悬浮。
培养 🐠 27 天 🐳 。
3. 球体形 🪴 成 🌴
在培养过程中 🌺 ，细胞会开始聚集形成球体。
使用显微镜定期观察球体的形 🐎 成。
4. 球 💮 体收获 🐶
当 🐒 球体达到所需大小（通常为 50200 μm）时，停止悬浮。
使用移液枪小 🐟 心 🐘 收 🌲 集球体。
将球体转移到新的培 🐼 养基中，进行进一步培养或分析。
结果在悬浮培养期间，干细胞会聚集形成球体。这些球体具有 🐦 以下特性：
自我更新：球体 🐒 可以持续分裂和增殖 🪴 。
多能性：球体分化成多种细 🦉 胞 🦅 类型，包括成骨细胞成、软骨细胞和成脂肪细胞。
无 🐦 支架：球体悬浮在培养基中，不需要支架或基底膜的支撑。
应用干细胞球体在以下应用中具有 🌺 潜力：
再生医 🌿 学：用于修复受损组织或器官。
药物筛选：用于 🦅 测试候选 🌴 药 🦍 物的毒性或有效性。
干细胞研究：用于研究细 🐘 胞分化、发育和疾病的机制。
