小鼠骨髓干细胞制备（小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备与观察）
- 作者: 杨艺澄
- 来源: 投稿
- 2024-12-31
1、小鼠骨髓干细胞制备
小鼠骨髓干细胞制备
材料：小鼠
DMEM 培养基
FBS青霉素链霉素
2% EDTA
10% 小牛血清
培养板细胞计数器
步骤：1. 小鼠处死：使用 CO2 或异丙酚使小鼠镇静，然后断头。
2. 取出股骨：在无菌条件下，切开小鼠皮肤，暴露股骨。
3. 去除骨髓：用 2% EDTA 溶液冲洗股骨，将骨髓细胞冲出。
4. 收集骨髓细胞：将冲出的细胞收集到培养板中。
5. 离心：以 300 x g 离心 5 分钟，去除上清液。
6. 清洗：用 DMEM 培养基清洗骨髓细胞两次，每次离心 5 分钟。
7. 计数：使用细胞计数器计数骨髓细胞。
8. 复悬：将骨髓细胞复悬在含 10% FBS 和青霉素链霉素的 DMEM 培养基中。
9. 培养：将骨髓细胞以 1 x 10^6 个细胞/mL 的密度接种到培养板中。
10. 更换培养基：每 34 天更换一次培养基。
培养物特性：
培养约 710 天后，细胞将形成细胞集落。
这些细胞集落由造血干细胞、间充质干细胞和其他骨髓细胞组成。
骨髓干细胞可以进一步分化为不同的造血细胞谱系，例如红细胞、白细胞和血小板。
注意事项：
始终在无菌条件下进行操作。
使用新鲜的小鼠骨髓获取最佳结果。
骨髓细胞培养非常敏感，应小心操作。
2、小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备与观察
材料小鼠骨髓
溶血缓冲液
甲醛醋酸钾
冰乙醇
显微镜载玻片
盖玻片阿塞托乳酸染色液
步骤1. 骨髓收集
对小鼠实施无菌手术，取出股骨和胫骨。
用 1 ml 溶血缓冲液冲洗骨髓腔，将骨髓细胞收集到 50 ml 的离心管中。
在 1200 × g 下离心 10 分钟。
2. 固定
弃去上清液，用 1 ml 甲醛固定细胞 15 分钟。
在 1200 × g 下离心 5 分钟。
3. 亚细胞分裂
弃去甲醛，用 3 ml 醋酸钾（60%）亚细胞分裂细胞 10 分钟。
在 1200 × g 下离心 5 分钟。
4. 染色
弃去醋酸钾，用冰乙醇固定细胞至少 30 分钟（最长可过夜）。
将细胞悬浮在几滴阿塞托乳酸染色液中。
在载玻片上滴加一滴细胞悬液，轻轻盖上盖玻片。
5. 观察
将载玻片放置在显微镜下，使用 100 倍油浸镜头观察染色体。
识别和分析不同阶段的细胞分裂。
注意所有实验步骤均应在无菌环境中进行。
醋酸钾和甲醛为腐蚀性物质，在使用时请佩戴适当的个人防护设备。
阿塞托乳酸染色液易燃，请远离火源。
3、小鼠骨髓间充质干细胞培养实验报告
小鼠骨髓间充质干细胞培养实验报告
间充质干细胞 (MSC) 是一种多能干细胞，存在于各种组织中，包括骨髓。小鼠骨髓 MSC (mMSC) 在组织工程和再生医学中具有广泛的应用前景。本实验报告描述了 mMSC 培养的优化方法，包括分离、培养和表征。
材料和方法
小鼠和小鼠骨髓提取
使用 68 周龄的 C57BL/6 小鼠。
处死小鼠并从股骨和胫骨中提取骨髓。
MSC 分离
将骨髓细胞悬浮在 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 中，并通过 70 μm 滤网过滤。
将细胞离心并 resuspend 在密度梯度离心液 (FicollPaque) 中。
离心细胞，收集界面处的单核细胞层。
MSC 培养
将单核细胞接种到含 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM 中，并在 37°C、5% CO2 条件下培养。
每 34 天换一次培养基。
MSC 表征
形态学: 染色细胞以观察其纺锤形形态。
表面标记: 使用流式细胞术分析细胞表面标记，如 CD34、CD45、CD73、CD90 和 CD105。
多向分化潜能: 将 MSC 诱导分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，并使用组织染色技术进行表征。
结果MSC 分离
密度梯度离心成功分离出单核细胞，其中包括 MSC。
MSC 培养
MSC 在富含生长因子的 DMEM 中快速扩增，表现出纺锤形形态。
MSC 在培养 23 周后达到最佳增殖速率。
MSC 表征
形态学: MSC 表现出典型的纺锤形形态。
表面标记: 流式细胞术分析显示 MSC 阳性表达 CD73、CD90 和 CD105，阴性表达 CD34 和 CD45。
多向分化潜能: MSC 可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。
讨论本实验建立了一种优化的方法来培养 mMSC。密度梯度离心提供了纯化的 MSC 群体，富含生长因子的 DMEM 支持了其快速增殖和多向分化潜能。这些结果表明，该优化方法将为进一步研究 mMSC 的生物学特征和治疗应用奠定基础。
结论本实验报告描述了一种优化的小鼠骨髓 MSC 培养协议。分离、培养和表征方法均进行了优化，确保了纯化的 MSC 群体。这些 MSC 表现出多向分化潜能，这使其成为组织工程和再生医学的潜在候选细胞。
4、小鼠骨髓间充质干细胞提取方法
小鼠骨髓间充质干细胞提取方法
材料：小鼠胫骨和股骨
PBS 缓冲液
胶原酶消化液（0.1% 胶原酶 IV + 0.1% 透明质酸酶）
流式细胞仪抗体： CD31FITC、CD45PE、CD90APC、CD73APC
培养基： 含 10% FBS 的 DMEM 低糖培养基
培养板流式细胞仪
操作步骤：
1. 收集骨髓：
处死小鼠，收集胫骨和股骨。
用 PBS 冲洗骨头，清除残留组织。
骨头末端剪断，用 10 mL 注射器和 25G 注射针冲洗骨髓进入 50 mL 离心管中。
2. 消化骨髓：
在 50 mL 离心管中加入胶原酶消化液，最终体积为 20 mL。
将离心管置于 37°C 振荡温箱中，消化 1 小时。
3. 过滤和离心：
使用 70 μm 细胞滤网过滤消化后的骨髓。
将滤液转移到 50 mL 离心管中，以 1500 rpm 离心 5 分钟。
弃上清液，收集沉淀。
4. 去除红细胞（可选）：
在沉淀中加入 1 mL 红细胞裂解液，室温孵育 5 分钟。
补加 PBS 至 10 mL，以 1500 rpm 离心 5 分钟。
弃上清液，收集沉淀。
5. 磁性珠免疫分离：
根据制造商的说明，使用磁性珠去除 CD31 和 CD45 阳性细胞。
免疫分离后的细胞重悬于培养基中。
6. 流式细胞分选：
将细胞样品与 CD90APC 和 CD73APC 抗体染色。
使用流式细胞仪分选出 CD90+CD73+ 阳性细胞。
7. 培养：
将分选出的细胞接种于培养板中，以 5×10^5 个细胞/mL 的密度。
在 37°C、5% CO2 培养箱中培养细胞。
每 23 天更换培养基。
注意：所有操作应在无菌条件下进行。
酶消化时间根据骨髓样品的实际情况进行调整。
流式细胞分选阈值应根据流式细胞仪的背景荧光进行优化。
培养细胞时，应定期监测细胞活力和形态。
