怎么培养胚胎干细胞（胚胎干细胞培养鉴定的方法 🐋 ）
- 作者: 张泽夕
- 来源: 投稿
- 2025-03-02
1、怎么培养胚胎 ☘ 干细胞 🦊
胚 🌺 胎 🐛 干细胞的培养
材料：无血 🌲 清培 🌿 养基（如mTeSR1或E8）
胚胎干细 🌼 胞
培 🐝 养皿或培养瓶
胚胎 🌿 干细胞级分离剂（如TrypLE Express）
细胞计 🦊 数 🐴 器 🐯
培 🐞 养 🐟 箱 🐼 （37°C，5% CO2）
步骤：1. 解冻 🌿 胚胎干细 🌵 胞：
将冷冻胚胎干细胞管置于 🦍 37°C 水浴中，涡 🕷 ，旋并轻轻敲 🕷 击管壁直到细胞解冻。
通过70 μm 细胞 🌾 过滤器转移到 50 毫升锥形离心 🕊 管中。
以 🌸 250 x g 离心 5 分钟，去 🕷 除培 🌼 养基。
2. 重 🐱 新悬浮细胞：
密闭吸取培养基并用 🐱 无血清 🐬 培养基 resuspend 细胞 🦉 。
轻轻涡 🦆 旋以确保 🌵 细胞均匀悬浮。
3. 计 🌼 数细 🦋 胞：
使 🌷 用细胞计数器计数 🌿 细胞。确保细胞悬浮均匀，没。有结块
4. 接种 🐯 细胞：
根据 🌺 培养细胞的数量和培养基体积 🐬 计算细胞密度。推荐密度为 0.251 x 10^6 个细胞/毫。升
将 🦊 细胞悬浮液接种到带有分离剂涂 🌷 层的培养皿或培养瓶中。
轻柔地摇 🐯 动培养皿或培养瓶以 🌲 均匀 🐛 分布细胞。
5. 培 🐠 养细 🌹 胞 🦟 ：
将细 🌷 胞置于 🐱 培养箱 🌼 中（37°C，5% CO2）。
每日换取新鲜无 🐵 血清 🐝 培养基 🦆 。
培养 34 天，或直至细胞达到 7090% 的 🌼 汇合度。
6. 分 🌲 离细 🌳 胞：
去除培养基并用无血清培养 🌺 基洗 🐺 涤细胞一次。
加 🌴 入分离剂（如 🐞 TrypLE Express）并孵 🦟 育分 510 钟。
用移液 🌺 管轻柔地吹 🍀 打细胞，使细胞脱离培养皿或培养瓶。
补充无 🐛 血清培养基 🐒 以终止分离。
通过 70 μm 细胞过滤器转移细胞悬浮液 🌴 。
离心细胞（250 x g，5 分钟），去除培养基 💐 。
7. 重 🐝 复步骤 🦢 26 进行传代：
接种细胞至新的培养皿或培养 🐳 瓶中 🌴 。
重复步 🐞 骤 26 以进行 🌸 传代培 🌾 养。
注意 🦅 事项 🦊 ：
使用无菌技术以防止 🕷 污染。
定期监测细胞生 🌵 长并根据需要进行传代。
胚胎干细胞培养应在符 🦆 合 GLP 规 🐱 范的设施 🕊 中进行。
2、胚胎干细胞培养鉴定 🦋 的方法
胚胎干细胞培养 🌳 鉴定 🦈 的方法 🐬
1. 形 🌹 态学 🦄 观察 🌲
形态特征：胚胎干细胞呈圆形或卵形，具有明显的核 🌷 仁和高核质比
生长 🐝 方式：通常以紧密贴壁的小群体形式生长形，成无色晶莹光泽 🌻 的菌落
2. 免疫表 🌸 型分析
表面标志：胚胎干细 🦊 胞表达特异的表面标志，如：
SSEA3 (阶 🐟 段 🦍 特异性胚胎抗原3)
SSEA4 (阶段特异性胚胎抗 🐯 原4)
TRA160 (肿瘤 🐛 相关抗原160)
TRA181 (肿 🕊 瘤相关抗 🐅 原181)
3. 分化潜 🦄 能评 🦁 估 💐
三胚层分化胚：胎干细胞具有分化为 💮 外胚层、中胚层和内胚层的潜能。可。以通过悬浮培养或引导分化来验 💐 证其 🌻 分化能力
畸胎瘤形成实验：将胚胎干细胞注射到免疫缺陷小鼠体内，观察其是否形成含有内胚 🐡 层、中胚层和 🦟 外胚层组织 🐅 的畸胎瘤。
4. 基因表达 🌼 分析
特异基因 💐 表达：胚胎干细胞表达特定基因，如：
Oct4 (卵 🕊 细 🐒 胞核因子 🦈 4)
Sox2 (性 🌸 别决定因子 SRYbox 2)
Nanog (家 🕸 庭 🦢 盒 B 因子 🌴 )
基因表达谱分析：比较胚胎干细胞与其他细胞类型的基因 🐕 表达谱，可 🐟 以鉴定出特异的胚 🦄 胎干细胞标志基因。
5. 染色体核型 🕷 分析
染色体数目和结构：胚胎干细胞 🦟 应具有正常 🍁 的人类染色体组 🍁 型，包括 46 个染色体。
染 🌼 色体异常染色体异常：会影响胚胎干细胞的分化潜能和稳定性。
6. 其 🌹 他 🐎 方 🕊 法
细胞周期分析 🌹 ：胚胎干细胞具有快速的细胞增殖率和独特的细胞周期特性。
特拉链酶活性检测：胚胎干细胞具有高水平的端粒 🐡 酶活性，一种维持染色 🍀 体稳定 🍁 性的酶。
甲基化分析：胚胎 🐈 干细胞的 🐛 甲基化 DNA 模式与其他细胞类型不 🐛 同。
3、怎么培 🌵 养胚胎 🐠 干细胞的方法
培养人类胚胎干细 🐕 胞的方法
材料：未分 🐈 化胚泡（来 🐕 自接 🕷 受知情同意后捐赠的胚胎）
人类胚胎 🐛 干细胞培养基 🌵 （含有因子、生长因子和抗生素）
培养皿（涂 🌷 有基 🐱 质胶 🌻 ）
步骤：1. 解冻胚胎 🦍 ：将冷冻的胚胎在 37°C 水 🐒 浴中解冻。
2. 去除外层透明带：使用酸性Tyrode溶液 ☘ 去 🌵 除围绕胚胎的外 🦁 层透明带。
3. 解聚胚胎：使用蛋白酶或胶原酶将胚 🐒 胎解聚成单细胞。
4. 接种到培养皿：将解聚的细胞悬浮液接种到含有培养基的培 🌷 养 🌼 皿中，使细胞附着在涂有基质胶的表面上。
5. 培养：在 🍁 37°C、5% CO2、高湿 🐘 度的条件 🦟 下培养细胞。
6. 换液：每 🐕 隔 23 天更换培养基，以提供新鲜的营养物质和因子。
7. 传代：当细胞达到 🌻 8090% 的汇合 🍀 度时，使用胰蛋白酶将其传代到新的培养皿中。
8. 维持未分化状 🐟 态 🐯 ：在培养过程中，添加特定因子（例如 FGF2 和 TGFβ）以维持细胞的未分化状态。
注意：培养人类胚胎干细胞受国家和国际法规严格监 🐧 管。在进 🐛 行任何研 🐯 究之前，必。须获得适当的许可证
胚胎干细胞培养需要采用无菌技术和培养基质量控制，以 🍀 确保细胞的健康和 🌲 安全 🐅 性。
胚胎干细胞在体外培养时具有形 🐈 成畸胎瘤（肿瘤）的潜能。因此，使。用前需要仔细评估其分化状态和安全特性
4、胚胎干细胞培 🦊 养的注意事项
胚胎 🕷 干细胞培养的注意 🦆 事项
胚胎干细 💐 胞 (ESC) 培养需要严格遵守特定条件以确保细胞的健康和 🪴 活力以 🐒 。下是一些关键注意事项：
无菌条 🐟 件：
始终在无菌环境中 🐴 进行操作。
使用经过灭菌的材 🐒 料和设备。
定期清 🐅 洁工作区和培养 🐶 箱。
培养基：使用专门配制的 ESC 培养基，含有必要的生长因子和营 🪴 养物质。
定期 🌴 更换培养基以保持细 🌵 胞新鲜 🐝 度。
监测 🐒 培养基的 pH 值和 🌴 渗透 🐶 压。
培 🐟 养温度 🕷 和 🐡 CO2 条件：
将 🌿 细胞培养在 37°C 且 5% CO2 的恒温 🐈 培养箱 🐋 中。
CO2 有助于调节细胞 pH 值并抑制微生 🐱 物生长。
传代：定期传代细胞以 💐 防止过密。
分离出健康的细胞，并按适 🌿 当的比例重新播种到新鲜的 🐡 培养基中。
分化：ESC 具有无限增殖 🐈 和分化的能力。
控制分化 🐱 条件对于产生特定细胞 🪴 类 🐺 型至关重要。
细 🐺 胞 🦄 冻 🌻 存：
将 ESC 冻存 🦅 用于长期储存。
使用专门配制的冷冻保存液保护细胞免 🐟 受 🐞 冻 🕷 害。
遵循严格的 🕷 冷冻和 🌴 解 🐒 冻程序。
监测 🪴 细胞 🐝 健康：
定期监测细胞的形态、增殖率和分化 🌹 能力。
使用活细胞染色或免疫组化技术评估细 🐛 胞的健康状况。
其他注意事项 🦊 ：
避免 🐱 细胞过密或稀疏。
保 🦢 护细胞免受 🐅 光 🐬 或紫外线照射。
使用高质量的细胞株并 🐕 定期验证其特性。
遵循实验 🐺 室的标准操作程序 (SOP)。
遵守 🕊 法 🐕 规 🐯 ：
遵守 🦉 与 ESC 培养相关的当地和国家法规。
获取必要的许 🐠 可证 🌷 和批准 🌷 。
使用经过 🐕 认证的实验室 🐳 进行培养。
