小鼠骨髓如何取干细胞（小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备和观察）
- 作者: 杨默一
- 来源: 投稿
- 2024-12-29
1、小鼠骨髓如何取干细胞
小鼠骨髓干细胞的获取
材料：小鼠
无菌工作台
无菌手术刀片
无菌镊子
无菌剪刀
培养皿含EDTA的血清培养基（例如，PBS + 2mM EDTA）
冰块过滤柱（40μm网孔）
离心机程序：
1. 麻醉小鼠：使用异氟烷或二氧化碳麻醉小鼠。
2. 消毒手术区域：用70%乙醇消毒小鼠的后腿和腹部。
3. 定位骨髓：将小鼠仰卧放置，后腿向上抬起。确定后腿的股骨和胫骨。
4. 移除后腿：使用无菌手术刀片切断大腿与躯干的连接处。
5. 分离股骨和胫骨：使用无菌镊子将股骨和胫骨从肌肉和周围组织中分离出来。
6. 去除骨膜：使用无菌镊子小心地去除覆盖骨头的薄膜（骨膜）。
7. 剪断骨头：使用无菌剪刀剪断股骨和胫骨的两端。
8. 冲洗骨髓：将含EDTA的血清培养基装入注射器，连接到18号针头上。将针头插入骨腔，然后缓慢用力冲洗出骨髓。
9. 收集骨髓：将骨髓悬液收集到培养皿中。
10. 过滤骨髓：使用40μm网孔的过滤柱过滤骨髓悬液，去除细胞碎片和其他杂质。
11. 离心：将过滤后的骨髓悬液在4℃下，1200rpm离心5分钟。
12. 重悬干细胞：将沉淀收集到无菌培养皿中，并用新鲜的血清培养基重悬。
注意：在无菌条件下进行所有操作。
使用麻醉小鼠，以减少疼痛和不适。
轻柔地操作骨头，避免损坏骨髓细胞。
尽最大努力以获得尽可能多的骨髓细胞。
骨髓干细胞可以存储在液氮中，以备将来使用。
2、小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备和观察
小鼠骨髓造血干细胞染色体的制备和观察
材料和设备：
小鼠骨髓
PBS 缓冲液
去铁剂固定剂（甲醇：醋酸 = 3:1）
染色剂（瑞氏染色剂）
载玻片和盖玻片
显微镜染色器分析软件
程序：1. 骨髓细胞的收集：
将小鼠处死，取出股骨和胫骨。
切断骨的末端，并用 PBS 缓冲液冲洗骨髓腔。
将骨髓悬浮在 PBS 缓冲液中。
2. 去铁：
向骨髓悬浮液中加入去铁剂，并孵育 30 分钟。
用 PBS 缓冲液离心洗涤细胞 3 次。
3. 固定：
向细胞中加入固定剂，并孵育至少 2 个小时。
用 PBS 缓冲液离心洗涤细胞 3 次。
4. 染色：
将细胞悬浮在瑞氏染色剂中，并孵育过夜。
用 PBS 缓冲液离心洗涤细胞 3 次。
5. 制片：
在载玻片上滴加一滴细胞悬浮液，并用盖玻片盖住。
用除皱纸轻压盖玻片，去除多余的液体。
6. 观察：
在显微镜下观察染色体，并进行核型分析。
使用染色器分析软件，可以确定染色体的数量和形态。
结果：染色良好的小鼠骨髓造血干细胞染色体，具有清晰的着丝点和染色体臂。
核型分析可以确定染色体的数量和形态，并识别任何异常情况。
应用：研究小鼠造血干细胞的染色体异常
诊断骨髓相关疾病，如白血病
监测造血干细胞移植的成功率
3、如何检测小鼠骨髓干细胞的活性
小鼠骨髓干细胞 (BMSC) 活性检测方法
体外检测：
增殖检测：测量 BMSC 在培养基中增殖的能力，可以使用 MTT、CCK8 或克隆形成单位 (CFU) 测定。
分化潜能：评估 BMSC 分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞的能力，可以使用染料染色或 RTPCR 分析。
迁移和侵袭测定：使用 Boyden 室或 Transwell 孔板测量 BMSC 的迁移和侵袭能力。
分泌因子分析：使用 ELISA 或免疫印迹分析测量 BMSC 分泌的细胞因子和生长因子，这些因子参与组织修复和免疫调节。
体内检测：
骨形成模型：将 BMSC 移植到免疫缺陷小鼠的股骨或胫骨中，然后 X 光或组织学检查形成的新骨。
软骨形成模型：将 BMSC 移植到皮下或肌内，然后组织学检查形成的新软骨。
脂肪形成模型：将 BMSC 注射到小鼠的皮下或腹膜中，然后解剖检查形成的新脂肪组织。
疾病模型：将 BMSC 移植到患有特定疾病（例如骨质疏松症或关节炎）的小鼠中，然后评估治疗效果。
其他检测：
流式细胞术：使用表面标记（例如 Sca1、CD34、CD45）来区分和表征 BMSC 群体。
单细胞 RNA 测序：分析 BMSC 的转录组，以了解其异质性和功能。
基因编辑：使用 CRISPRCas9 或其他基因编辑技术，在 BMSC 中引入特定的基因修改，以研究特定基因对 BMSC 活性的影响。
注意事项：
根据不同的实验目的，选择合适的检测方法。
优化培养条件和测定方法，以确保结果的可靠性。
使用适当的阳性对照和阴性对照。
考虑体内和体外检测结果之间的差异，并谨慎解释结果。
4、小鼠骨髓间充质干细胞提取方法
小鼠骨髓间充质干细胞（BMMSC）提取方法
材料：68 周龄小鼠
70% 乙醇
PBS除血清培养基（αMEM 或 DMEM）
胎牛血清（FBS）
胰蛋白酶（0.25%）
红细胞裂解液（0.15M NH4Cl）
培养板或培养瓶
步骤：1. 准备小鼠
给小鼠腹腔注射 1ml 70% 乙醇以消毒。
将小鼠麻醉。
用剪刀剪开腹腔。
2. 取出股骨和胫骨
用无菌镊子小心地取出两只股骨和两只胫骨。
除去附着在骨骼上的肌肉和脂肪组织。
3. 骨髓冲洗
将骨骼转入一个装有除血清培养基的培养板或培养瓶中。
使用无菌移液管向骨骼中注入除血清培养基，冲洗出骨髓。
用移液管收集冲洗液。
4. 消化骨髓
将冲洗液转移到一个新的培养板或培养瓶中，加入 10ml 胰蛋白酶。
将混合物孵育于 37°C，持续 30 分钟。
加入 10ml FBS 终止胰蛋白酶反应。
5. 离心
将消化后的骨髓悬液离心 10 分钟，1000 rpm。
小心吸掉上清液。
6. 红细胞裂解
向细胞沉淀中加入 10ml 红细胞裂解液。
孵育 5 分钟，室温。
加入 10ml PBS 终止红细胞裂解。
7. 离心
再次离心 10 分钟，1000 rpm。
小心吸掉上清液。
8. 重悬细胞
向细胞沉淀中加入 10ml 除血清培养基。
吹打细胞悬液以使其完全重悬。
9. 培养
将细胞悬液接种到涂有 10% FBS 的除血清培养基的培养板或培养瓶中。
将培养物孵育于 37°C，5% CO2。
10. 更换培养基
培养 24 小时后，更换培养基，去除未贴壁的细胞。
以后每隔 34 天更换一次培养基。
提示：确保所有仪器和材料都无菌。
动作轻柔，避免损坏 BMMSC。
观察培养物，当达到约 80% 的汇合度时即可传代。
BMMSC 可传代培养多年。
