人脐带间质干细胞分离（人脐带间充质干细胞原代培养方法）
- 作者: 杨唯希
- 来源: 投稿
- 2025-01-09
1、人脐带间质干细胞分离
人脐带间质干细胞分离
材料新鲜脐带
Hanks 平衡盐溶液 (HBSS)
胶原酶 IV
胰蛋白酶
培养基（如 DMEM/F12 培养基，含 10% FBS）
离心机细胞培养瓶
步骤1. 收集并清洗脐带：收集新鲜脐带，并用 HBSS 彻底清洗，去除血液和杂质。
2. 切割和剪碎脐带：用手术刀将脐带切成小块，然后用无菌剪刀将其剪碎。
3. 酶解：将碎脐带悬浮在胶原酶 IV 和胰蛋白酶溶液中，在 37°C 下孵育 1530 分钟。酶解有助于分离间质干细胞。
4. 终止酶解：加入培养基终止酶解过程。
5. 过滤和离心：将悬浮液过滤以去除残余的未消化的组织，然后在离心机中离心 10 分钟以收集细胞。
6. 重悬和培养：将细胞重悬在培养基中，并接种到细胞培养瓶中。在 37°C、5% CO2 下培养。
7. 去除非贴壁细胞：培养 2448 小时后，去除非贴壁细胞。间质干细胞通常会贴壁，而其他细胞类型（如血细胞）则会悬浮。
8. 更换培养基：每 34 天更换一次培养基，以提供新鲜的营养和去除废物。
鉴定可以通过以下方法鉴定分离的人脐带间质干细胞：
免疫表型：使用 CD105、CD90 和 CD73 等特异性表面标记进行免疫表型分析。
分化潜能：将细胞诱导分化为脂肪、骨或软骨细胞，以验证其三胚层分化潜能。
克隆形成单元 (CFU) 分析：评估细胞形成克隆的能力，表明其自我更新能力。
2、人脐带间充质干细胞原代培养方法
人脐带间充质干细胞原代培养方法
材料和试剂
新鲜人脐带
Dulbecco's改良鹰氏培养基（DMEM）
胎牛血清（FBS）
青霉素/链霉素
胶原酶IV
胰蛋白酶
0.25% 胰蛋白酶EDTA 溶液
流动细胞仪
细胞培养瓶和培养板
步骤1. 收集脐带
从无菌条件下收集新鲜的人脐带。
用无菌生理盐水冲洗脐带，去除任何血液或组织碎片。
2. 切割脐带
将脐带切成小段（约 12 cm）。
用解剖剪刀将血管和羊膜从脐带中分离出来。
3. 消化脐带
将脐带段放入含有胶原酶 IV（1 mg/mL）的 DMEM 溶液中。
在 37°C 条件下孵育 90 分钟，同时不断搅拌。
用等体积的 DMEM 溶液终止消化。
4. 过滤和离心
用 100 μm 滤网过滤消化后的混合物，以去除未消化的组织碎片。
将滤液转移到离心管中，并在 1200 x g 下离心 15 分钟。
5. 去除上清液并重悬细胞
小心移除上清液。
用含 10% FBS 的 DMEM 重悬细胞。
6. 种植细胞
将细胞悬液接种到预先涂有 0.25% 胰蛋白酶EDTA 溶液的细胞培养瓶或培养板中。
在 37°C 且 5% CO2 的条件下培养细胞。
7. 培养基更换
每隔 34 天更换培养基，以去除代谢废物并补充营养物质。
8. 传代
当细胞达到 7090% 汇合度时，即可进行传代。
将培养基轻轻吸出，并用 0.25% 胰蛋白酶EDTA 溶液处理细胞。
一旦细胞从培养基底脱落，则用含 FBS 的 DMEM 中和胰蛋白酶。
将细胞悬液转移到新的细胞培养瓶或培养板中。
9. 表征细胞
培养 23 周后，进行流动细胞仪分析，以鉴定间充质干细胞表面标志物（如 CD73、CD90 和 CD105）。
进行分化实验，以确定细胞向骨、软骨和脂肪细胞分化的能力。
3、脐带血间质干细胞治疗的副作用
脐带血间质干细胞治疗的潜在副作用
急性不良反应
发热寒战
恶心
呕吐
头痛
皮肤反应（如皮疹、瘙痒）
长期副作用（罕见）
免疫反应移植物抗宿主病（GVHD）：供体干细胞攻击受体，导致组织损伤。
排斥：受体免疫系统排斥供体干细胞。
肿瘤形成由于干细胞的无限增殖能力，可能会形成肿瘤。
其他副作用
肺部问题（如呼吸困难、喘息）
心脏问题（如心律失常）
肝脏问题（如肝炎）
神经系统问题（如癫痫发作、认知障碍）
死亡（在极少数情况下）
风险因素以下因素可能会增加副作用的风险：
供体和受体的免疫学差异
基础疾病的严重程度
治疗剂量
使用免疫抑制剂
管理策略预防
仔细匹配供体和受体以最大限度地减少免疫学差异。
使用免疫抑制剂来防止排斥和GVHD。
治疗急性不良反应：止痛药、抗组胺药、激素等支持疗法。
免疫反应：增加免疫抑制剂剂量、使用抗GVHD抗体。
肿瘤形成：化疗、放疗。
其他副作用：取决于具体情况，可能需要特定的治疗措施。
需要注意的是，脐带血间质干细胞治疗的总体副作用发生率相对较低。患者在接受治疗前应充分了解潜在风险和益处。
4、人脐带间充质干细胞多少钱
人脐带间充质干细胞的费用取决于医院、治疗方法和地理位置等因素。一般来说，成本可能在人民币 100,000 元到 500,000 元之间。
请注意，这些费用仅供参考，具体费用可能因具体情况而异。建议您联系医疗保健提供者以获取准确的报价。
