小鼠脂肪干细胞提取（小鼠脂肪干细胞 🕸 提取用多少比例的胶原酶）
- 作者: 李鸣岐
- 来源: 投稿
- 2025-03-30
1、小鼠脂肪干细胞提取 🐵
小鼠 🐧 脂肪 🐠 干细胞提取
材料：68 周龄 C57BL/6 小鼠 🐎
70% 乙 🌺 醇 🐺
无菌手 🪴 术器 🌵 械 🌲
生理 🐯 盐 🐛 水
胰 🕊 酶 🌴 （1 mg/mL）
胶 🌳 原 🌾 酶 🐶 IV（1 mg/mL）
预 🍁 冷的 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
离心机培养基（DMEM 补充 10% 胎牛血清 (FBS) 和 🦈 1% 青霉素/链霉素）
步骤：1. 准备 🦄 小 🌷 鼠：
将小鼠进行麻醉 🐟 。
用 70% 乙醇对小 🕸 鼠腹部分布区域 🐋 进行消毒。
2. 切 🐼 除脂肪组 🐕 织 🐴 ：
用无菌手术器械做一个约 1 cm 的 🦁 切口。
小心剥离皮肤，暴露出腹部 🐕 的脂肪组织。
用无菌镊子夹 🐝 住 💮 脂肪组织并切除约 0.5 克 💐 。
3. 消化 🐯 脂 🦆 肪组织 🐎 ：
将脂肪 🕊 组织转移到无菌培 🐛 养皿中。
加入 5 mL 生理盐 🌷 水并轻轻搅拌 🐦 ，以去除多余的血液 🐶 。
移液弃掉生理盐水 🍀 。
加 🦟 入 5 mL 胰 🦅 酶 🐶 溶液，并孵育 30 分钟，37°C。
移液 🦈 弃 🐒 掉胰酶 🌸 溶液。
加 🌾 入 5 mL 胶原酶 IV 溶液，并孵育 1 小时，37°C。
4. 收获干 🌸 细胞 🐯 ：
将脂肪组织消化物转移到 🐒 50 mL 离心管 🐳 中。
加入 🌷 15 mL 预冷的 DMEM。
以 🦢 300 x g 离心 10 分 🐕 钟 🐬 ，4°C。
小心 🌷 弃掉上清液。
重悬沉淀物 🍀 在 10 mL 培养 🦟 基中 🐒 。
以 🦄 300 x g 离心 🐦 5 分钟，4°C。
小心弃 🌷 掉上清 🐼 液 ☘ 。
5. 培 🐧 养干细 🌺 胞 🦄 ：
将干细胞重悬在 5 mL 培 🐳 养基中。
将细胞接种到培 🐧 养皿中。
将 🐯 细胞置于 37°C、5% CO2 的培养箱 🐡 中 🌺 。
注意事 🐝 项 🦢 ：
在无菌条件下进行所有 🌻 步骤 🐈 。
小心 🌿 处理 🐬 脂肪 🐈 组织和干细胞，避免损坏细胞。
根据细胞的生长情况调整培养 🐱 基 🐘 更换频率。
2、小鼠脂肪干细胞提取 🌿 用多少比例的胶原酶
通常情况下，小鼠脂肪干细胞的提取使用的 0.10.2% 胶原酶。该，浓。度足以有效分解脂肪组织的细胞外基质同时 🐒 最小化对干细胞的损伤
具体浓度取决于胶原酶的类型、脂肪组织的特性 🌺 以及所使用的提取方法。例 🍀 如：
胶 🌺 原 🌳 酶 🐶 I: 0.10.2%
胶 🌹 原酶 II: 0.10.15%
胶 🦉 原 💐 酶 🐡 IV: 0.20.3%
选择适当的胶原 🐝 酶浓度非常重要。过高浓度的胶原酶会损坏干细胞，而。过低浓 🐱 度的胶原酶可能无法有效分解脂肪组织
3、小鼠脂 🕊 肪 🌴 干细胞提取实验报告
小鼠脂肪干细 🌳 胞提取实验报告 🕸
一、实 🦊 验目的
掌握小鼠 🐎 脂肪干细胞的 🐛 提取方法
分离和鉴定小鼠脂 🐬 肪 🌼 干细胞 🦉
二、材 🐠 料和 🐯 方法
材料：C57BL/6 小 🐕 鼠 🐦
无 🦉 菌手 🦉 术 🌷 器械
培养基 🐈 ：DMEM 低糖培养基（含 10% FBS）
胰 🦄 蛋 🌿 白酶 🌷
红细胞溶 🐦 解 🕷 液
抗 🐴 体 🐯 ：CD34、CD45、CD90 和 🐞 CD105
流 🪴 式细 🌹 胞仪
方法：1. 脂肪组织采 🐳 集：
麻醉小鼠 🐯 后，沿，背部中 🌾 线切开皮肤和皮下组织暴露腹膜。
小心收 💐 集腹 🦉 膜 🐼 脂肪组织，避免损伤内脏器官。
2. 消化 🌷 脂 🍁 肪 🐞 组织：
将脂肪组织 🐕 切成小 🦊 块，置于含 1% 胰蛋白酶的培养基中。
37°C 孵育 🐎 30 分钟 🐘 ，每分钟 5 振荡一次。
3. 分 🌾 离细 💐 胞 🦉 ：
消 🦆 化结束后，用 DMEM 培养基终止消 🐧 化反应。
过滤细胞悬液，去 🌾 除未消化的组织碎片。
用 🐦 红 🐕 细胞溶解液溶解红细 🪴 胞。
4. 免 🦍 疫表 🌺 型分析 🪴 ：
使用抗 CD34、CD45、CD90 和 🌷 抗 CD105 体 🐘 对细胞悬液 🌺 进行免疫染色。
孵育 🐕 后，用流式细胞仪分析细胞表面标记表达。
三、结果1. 流式细胞仪 🐱 分析：
流式细胞仪分析显示分，离出的 🐱 细胞悬液中约有的细 🐋 胞 510% 表达 CD90 和 CD105，同时不表达和 CD34 符 CD45，合脂肪干细胞表型特 🌸 征。
2. 体 🐶 外 🦟 培养 🐴 ：
分离出的脂肪干细胞接种到含的 10% FBS 培 DMEM 养基 🐺 中。
细胞在培养条件下贴 🐠 壁生长，并显 🐕 示出良好的 🍀 增殖和分化能力。
四、讨论脂肪干细胞 🍀 是一种具有多向分化潜能的干细胞。本实验报告描述了小鼠脂肪干细胞的提取方法，并。且。通过流式细胞仪分析和体外培养验证了分离细胞的脂肪干细胞特性这项技术对于研究脂肪干细胞的生物 🐡 学特性和临床应用具有重要意义
4、大鼠脂 🐟 肪间充质干细胞提 🦈 取
大鼠脂肪间充质干细胞提 🐛 取 🦈
材料：大鼠
无 🐴 菌手术器械 🐵 （镊子、剪、刀止血钳）
无 🌵 菌 🐕 培 🐎 养液（如 PBS、DMEM）
无菌 🐟 离心 🐅 管 🌲
滤器（100 μm 和 🦆 40 μm）
培 🐶 养 🍀 基（如 🌼 DMEMF12 + 10% FBS）
步骤：1. 大鼠麻醉和 💐 准备：
对大鼠进 🐘 行麻醉。
剃除取样部位的毛发 🌲 并用消 🐺 毒剂 🐋 消毒。
2. 脂肪组 🐧 织 🍁 切除：
在无菌 🌼 条 🌴 件下，用无菌手术器械在取样部位做一个 12 cm 的切口。
用镊子轻轻切除 🐎 一 🐺 小块脂肪组织（约 12 克）。
用 🦆 止血钳止血。
3. 组织 🌷 剪碎和 🪴 消化 🐡 ：
将脂肪组织切碎成小块，放 🐛 入无菌培养液中。
加入胶 🍀 原酶溶液 ☘ （约 1 mg/mL），混合均匀。
在 37°C 的摇 🦊 床孵育器中 🌸 孵育 6090 分 🌳 钟。
4. 过 💮 滤和离心：
将消化后的组织通过的 100 μm 滤器过滤 🪴 ，去除组织残渣。
将滤液通过 40 μm 的滤 🐧 器过滤，收集细胞。
将 🐡 细胞离心 10 分钟 🐴 ，1000 x g。
5. 红 🦄 细 🦄 胞裂 🐋 解：
将 🌸 细胞悬浮在红细胞裂解液中（约 1 mL），室 🦊 温孵育 510 分钟。
离心 🌵 5 分 🌸 钟 🦍 ，1000 x g。
去除上清液，用培养基洗 🌾 涤细胞一次。
6. 细 🌷 胞培养 🌷 ：
将细胞 🌹 悬浮在培养基中，以 1 x 10^6 个细胞/mL 的密度接种。
置于 37°C、5% CO2 的孵育 🐛 器中 🦢 培养 🌺 。
培 🐋 养基 🌳 更 🐦 换：
每 23 天更 🐞 换一次 🐳 培养基 🌳 。
细 🕷 胞 🐟 收 🐘 获：
当细 🦄 胞长至 🌴 8090% 汇合时，即可收获。
用胰蛋白酶 🦍 溶液处理 🐕 细胞，并通过离心收集。
注意：在整个过程中保持无菌条件 🦆 至关重 🦉 要。
不 🐅 同大鼠品系可能会影 🦊 响干细胞的 🐘 提取效率。
培养基中血清的质量和浓度会影响干细胞的增 🌻 殖和分化。
