分离小鼠干细胞的方法 🐶 （分离小鼠原代成纤维细胞时,需要受孕多少天的小鼠）

1、分 🌾 离小鼠 🌳 干细胞的方法

分离小 🦊 鼠干细胞的方法

1. 机械 🌴 分 🌻 离 🍁

消化：使用胰蛋白酶或胶原酶等酶消化组织，将细胞 🌻 解离成单细胞。

离心：将消化后的组织悬浮液离心，去除非细 💮 胞碎片和死细胞 🦁 。

重悬 🕷 浮：将离心后的细 🐞 胞重新悬浮在合适的 🐡 培养基中。

2. 磁性活 🌳 化细胞分 🌾 选（MACS）

使用与 🦢 特定表 🌷 面标 🐕 记物结合的磁珠。

将磁珠与细胞悬 🐵 浮液 🐋 混合，结合的目标细 🐶 胞。

用磁场 🦍 将磁珠 🐋 附着 🐦 的细胞从非目标细胞中分离出来。

3. 荧光激活细胞分 🌼 选 ☘ （FACS）

使 🕸 用与特定表面标记物结合的荧光抗体。

用流式细胞仪检测细 🌸 胞表面上的荧光标记。

根据荧光强度，将目标细胞从非目标细胞中分离出 🕷 来。

4. 免 🪴 疫 🐺 亲和层析 🕊

使用与特定表面标记物结合的抗体偶联到亲 🪴 和层 🐠 析柱上。

将细 🌲 胞悬浮液流过柱子，目标细胞结合 🐛 到抗体 🐡 上。

洗脱柱 🐅 子以 🦆 收 🌴 集目标细胞。

5. 微流体 🦈 分离 🐺

使用微流体设备，根据特定特 🌼 性（如大小、形 🌷 状或 🌹 电荷）选择性地分离细胞。

细胞悬浮液流过微流体通道，目标细胞 🐎 被捕获或分离。

6. 细胞 🐧 培养

分离出的干细胞可以在合适的培养基中培养以，扩大数量 🌷 和保持分化潜能。

培 🐧 养条件因干 🌸 细 🦍 胞类型而异。

选择分离方法的考 🦁 虑因素 🦟 ：

干 🐟 细胞类型

目 🦋 标细 🌸 胞的丰 🪴 度

分离纯度 🕊 的 💐 要 🕸 求

可用 🌵 设备 🪴 和技术

成本和时间限 🌺 制 🍁

2、分离小 🐳 鼠原代成纤维细胞时,需要受孕多少天的 🐶 小鼠

E13.514.5

3、小鼠 🐒 肝细胞分离获得完整细胞需要注意哪些 🐝 问题

获得完整小鼠肝细胞分离的注意 🦆 事项 🐟 ：

1. 动物 🌳 准 🪴 备：

使 🦟 用健康 🦟 、成年小鼠（68 周龄）。

禁食动 🦉 物 1216 小时 🦊 ，以清除胆汁 🦟 。

使 🐼 用合适的麻醉剂（例 🐅 如戊 🌵 巴比妥钠）。

2. 肝 🪴 脏灌 💐 流 🐼 ：

使用胶原酶溶液（例如 🐧 ，Collagenase IV）通过门静脉灌流肝脏。

控 🌾 制灌流温度（37°C）和流量 🐡 （1015 mL/min）。

灌 🌾 流时间通常为 🐎 1015 分 🌳 钟。

3. 细 🐺 胞 🐺 分 🐕 离：

将肝脏 🐟 组 🦆 织剪碎并用培养基 💮 悬浮。

过滤悬浮液以去除未 🌹 消化 🐶 的组织块 🐼 。

进行离心以沉淀 🦁 细胞。

重 🦢 悬细胞并在培 🦁 养基中洗涤 🌹 多次。

4. 培 🌿 养 💮 基 🕷 ：

使用无 🦊 血清培养基（例如培养基，Williams' E 或）含血清替代剂的培养基。

将培养基补充胰岛素、转铁蛋白和皮质醇等 🐧 生长因子。

5. 培养条 🌹 件：

将细胞悬浮液接种在 🦢 带有胶原蛋 🌷 白涂层的培养皿中。

保持培养箱温 🐋 度 🐺 为 37°C，CO2 浓度为 🐺 5%。

定 🌷 期更换 🕷 培养基（每 23 天）。

6. 监测细 🐠 胞活力 🐟 ：

用台盼蓝染 🐺 料或共聚焦显微镜监测 🦊 细胞活力。

保持高活 🌸 力细胞比 🦟 例 🐵 (>85%)。

7. 避免细胞 🐅 破 🐱 裂：

在所有步骤 🌼 中小心操作 🌿 细胞，避免 🐦 过度搅拌或离心。

使用钝头移液管并保持细胞悬浮 🐅 液密度 🍀 适中。

8. 污染 🐳 控 🦟 制 🦅 ：

使用无菌技术并 🐋 定期更换培养基 🐅 。

使用 🍁 抗生 💮 素和抗真菌剂防止污染 🌲 。

定期检查培养物是否 🍀 存 🐅 在污染 🐅 迹象。

附加 🦍 提示 🕊 ：

优化胶原酶浓度和灌流时间以最 🕸 大限度地 🍀 减少细胞损伤。

使用新鲜的 🐘 肝脏组织 🌻 ，因为储存会 🦈 影响细胞活力。

在使用细胞之前，让 🐘 细胞在培养 🦁 基中稳定 2448 小时。

4、小鼠肝细胞的分离 🦆 技术和影响因 🐒 素探讨

小 🐵 鼠 🐶 肝细胞的分离技术

1. 胶原酶消 🕊 化法

利用胶原酶降解肝组织细胞外基质 🐟 ，释放肝细胞。

优点：分 🌵 离 🐕 效率高，产率 🐴 较高。

缺点 🌸 ：胶原酶对细胞有一 🌹 定毒性，可能影响细胞的活性 🦈 。

2. 肝门静 🦋 脉 🐘 灌流法 🦟

将胶原酶溶液灌流至肝门静脉，使胶 🦄 原酶均匀分布在肝组织中。

优点：分 🌲 离 🌲 效率高，细 🐧 胞损伤较小。

缺 🐕 点 🦋 ：操作复杂，设备要求高。

3. 两步 🦈 消 🐦 化 🦋 法

先用低浓度 🌸 胶原酶消 🐬 化肝组织，释，放肝细 🦋 胞簇然后用高浓度胶原酶进一步分离肝细胞。

优点：结 🐎 合了胶原酶消化法和肝门静脉灌流法的优点，分，离效率高细胞损伤较小 🦄 。

缺点：操 🐒 作 🌳 步骤 🌴 复杂。

影响小 🦄 鼠肝细胞分离效率 🌵 的因 🪴 素

1. 肝组织来源 🐟

小鼠的健康状况、年 🌹 、龄性别等 🐒 因素都会影响肝细胞的分离效 🌲 率。

2. 胶 🐶 原酶浓 🌲 度和消化时间

胶原酶浓度和消化时间应根据不同的实验要求进行优化。过。高浓度或过长 🦆 消化时间会导致细胞损伤

3. 缓冲 🐴 液选 🌺 择 🍁

缓冲液的 🐺 pH值、渗透压 🌷 等参数应与肝细胞培养条件相匹配 🦊 。

4. 离 🐋 心和过滤

离心和过滤有助于去 🐶 除杂 🌵 质和未 🐬 消化的组织碎片。

5. 细 🦟 胞培养 🕸 条 🐺 件

分离后的肝细胞应及时接种到培养皿中，并提供合适的培养条 💮 件（如温度培养、基组分等）。